Il Quality by Design nello sviluppo e nella convalida dei metodi analitici Giovanni Boccardi (AFI) Daniele Fraioli (Recordati SpA, Milano) Giorgio Marrubini (Università di Pavia, Dip. Scienze del farmaco)

Cos'è il Quality by design? «Un approccio sistematico allo sviluppo» «si attua prestabilendo obiettivi precisi» Pone in rilievo primario la comprensione e l’approfondimento del processo e del prodotto …e il controllo fondato su solide conoscenze scientifiche …e su metodi di quality risk management.

Spesso si confondono scopo e strumenti, assolutizzando il ruolo della statistica (lo stress testing è parte essenziale del QbD di un metodo analitico stability indicating senza contenere statistica). Spesso sembra un approccio riservato a grandi laboratori con speciali expertise & hardware & software La nostra proposta: descrivere come un comune laboratorio di sviluppo analitico possa recepire i principi Quality by Design (2013-2014!)

Prima fase1: ricerca di condizioni analitiche di partenza, utilizzando: conoscenza della sostanza (pKa, solubilità, LogD, impurezze di sintesi, stress testing, …) esperienza, letteratura, casi analoghi, scouting gradient, disegni sperimentali statistici, metodi di ottimizzazione automatici,.... 1 a nostro avviso ineliminabile e parte essenziale del QbD dei metodi analitici.

Seconda fase: identificazione delle fasi dell'analisi, per esempio: estrazione delle compresse + analisi cromatografica. N.B.: la moderna chimica farmaceutica presenta metodi complessi di estrazione e trattamento del campione anche per i principi attivi (vedi impurezze genotossiche).

Terza fase: identificazione degli obiettivi dell'analisi (analytical target profile) Esempio: ricerca di un'impurezza polare di processo con cromatografia HILIC: Sicurezza del paziente  specifiche (es. impurezza ≤ 0.05 %) Ne seguono criteri di accettabilità della convalida: es. LOQ ≤ 0.025 %. Da cui ricaviamo obiettivi per la separazione cromatografica (es.: k'≥ 3; 0.8 ≤ As ≤ 1.2)

Quarta fase: identificazione dei fattori e dominio sperimentale in cui è sostenibile una loro variazione (knowledge space)

Condizioni ambientali Separazione cromatografica pH Temperatura flusso volume iniezione Risultato Preparazione del campione solvente diss. volumi matracci pesate Filtrazione tempo agitazione Rivelatore Molarità del tampone % fase org. colonna lunghezza d'onda analitica lunghezza d'onda rif. Qualità alimentazione elettrica Temperatura lab. Umidità Incertezza titolo standard Eurachem: uncertainty in analytical measurement

(CONTROLLO STATISTICO) KNOWLEDGE SPACE DOMINIO SPERIMENTALE DESIGN SPACE ZONA DI ROBUSTEZZA (CONTROLLO STATISTICO)

Quinta fase: screening dei fattori per identificazione del rischio FATTORI PRESI IN ESAME LIVELLI 1. Acetonitrile nella fase mobile 75-95% 2. Sale (NH4OAc) 0-10 mM 3. Temperatura della colonna 18-40°C 4. pH della fase mobile (parte acquosa) 6 - 8 5. Volume di iniezione 5 – 25 µl 6. Flusso della fase mobile 0.1 – 0.5 ml/min RISPOSTE Fattore di ritenzione, 2 < k’ < 5 Simmetria, (quanto più possibile vicina a) 1

PIANO DEGLI ESPERIMENTI E RISULTATI Lo studio sistematico di tutte le combinazioni dei 6 fattori a 2 livelli richiede 64 esperimenti Un piano statistico degli esperimenti - può ridurre il numero di prove a 8 - consente di individuare i fattori critici per la separazione PIANO DEGLI ESPERIMENTI E RISULTATI Esp. n. ACN (%) [sale] (mM) T (°C) pH Vinj (µl) flusso (ml/min) Dummy k' Sym 1 95 10 40 6 25 0.1 -1 4.42 0.84 2 75 8 5 0.5 0.54 1.06 3 0.53 1.05 4 18 2.95 0.93 2.12 1.03 3.76 1.02 7 2.85 0.95 2.33 1.04

RISULTATI k': 0.53 – 4.42 Simmetria: 0.84 – 1.06 k' k' Simmetria ACN sale T pH Vinj flusso Dum k' ACN sale T pH Vinj flusso Dum k' ACN sale T pH Vinj flusso Dum Simmetria ACN sale T pH Vinj flusso Dum Simmetria

Metodo preliminare sviluppato Fattori non critici per la separazione: - Sale, escluso, si usa una fase mobile priva di NH4OAc - Temperatura 40°C - Volume di iniezione 5 µl Flusso 0.5 ml/min Fattori critici per regolare k’ e Sym: % ACN, pH Condizioni suggerite: ACN 95 % pH 6

Modello lineare in % ACN e pH (R2=0.973) Condizioni operative suggerite   pH 6.00 6.25 6.50 6.75 7.00 7.25 7.50 7.75 8.00 % Acetonitrile 75.0 2.10 1.92 1.74 1.56 1.38 1.20 1.02 0.84 0.66 77.5 2.36 2.18 2.00 1.82 1.64 1.46 1.28 1.10 0.92 80.0 2.63 2.45 2.27 2.09 1.91 1.73 1.55 1.37 1.19 82.5 2.89 2.71 2.53 2.35 2.17 1.99 1.81 1.63 1.45 85.0 3.16 2.98 2.80 2.62 2.44 2.26 2.08 1.90 1.72 87.5 3.42 3.24 3.06 2.88 2.70 2.52 2.34 2.16 1.98 90.0 3.69 3.51 3.33 3.15 2.97 2.79 2.61 2.43 2.25 92.5 3.95 3.77 3.59 3.41 3.23 3.05 2.87 2.69 2.51 95.0 4.22 4.04 3.86 3.68 3.50 3.32 3.14 2.96 2.78

Verifica della robustezza del metodo HPLC per impurezza di processo FATTORI PRESI IN ESAME LIVELLI Acetonitrile nella fase mobile 93 - 95 - 97% 4. pH della fase mobile 5.8 - 6.0 - 6.2 RISPOSTE Fattore di ritenzione, k’ Simmetria PARAMETRI OPERATIVI FISSI no NH4AcO Flusso 0.5 ml/min, T colonna 40°C, vol.inj. 5µl

Lo studio sistematico di tutte le combinazioni dei 2 fattori a 2 livelli richiede 4 prove Il piano statistico degli esperimenti ha previsto 4 prove + 2 repliche nelle condizioni usate in routine (ACN 95%, pH 6). Il metodo è risultato robusto nell’intervallo studiato per i due fattori ACN% e pH Esp.n. ACN% pH k' Sim 1 93 5.8 3.71 1.09 2 97 3.79 1.02 3 6.2 3.75 1.03 4 3.77 0.99 5 95 6.0 3.72 6 3.76 0.98

Ottava fase: descrizione del metodo (con intervalli permessi ) ACN 93 – 97 %, pH 5.8 – 6.2 Definizione del System suitability test (controllo del metodo!) k' ≥ 3 0.9 ≤ As ≤ 1.2

controllo storico delle prestazioni Nona fase: completamento della convalida è necessaria, per verificare tutte le assunzioni e l'assenza di interferenza di fattori "noise"1, come quelli ambientali; inoltre per determinare precisione ed accuratezza, dovrebbe essere molto basso il rischio di risultati critici della convalida; si può adottare un protocollo leggero per precisione intermedia. Ultima fase nel life-cycle controllo storico delle prestazioni 1 E. Rozet, P. Lebrun, P. Hubert, Trends in Analytical Chemistry, 2013, 42:157-167

Un esempio scelto dalla letteratura: P.F. Gavin and B. A. Olsen, A quality by design approach to impurity method development for atomoxetine hydrochloride (LY139603) J.Pharm.Biomed.Anal., 2008, 46:431 – 441 Scelta delle condizioni di partenza: ion-pair chromatography (per esperienza!)

Individuazione della zona di robustezza del metodo (Design space) FATTORI LIVELLI 1. Concentrazione acido o-fosforico 20, 30 mM 2. pH della fase mobile (parte acquosa) 2.3, 2.7 3. Concentrazione octansolfonato sodico 20, 30 mM 4. Concentrazione n-propanolo 26, 28 % 5. Temperatura della colonna 35, 45 °C (ogni livello replicato, più quattro repliche al punto centrale) RISPOSTE Pressione (bar) Risoluzione tra picchi imp.1 e imp.2 Risoluzione tra picchi imp.3 e imp.4 Risoluzione tra picchi imp.4 e imp.5 Tempo di analisi Tailing

Piano sperimentale Lo studio sistematico di 5 fattori a 3 livelli richiederebbe 243 prove Con un piano fattoriale frazionario gli esperimenti sono “solo” 20.

Acqua : n-prOH = 74:26 (%,v/v), 25mM H3PO4, 30mM OSA, pH 2.5, 35°C

Risultati SST

Conclusioni: nel QbD si valorizzano metodologie introdotte dagli anni '30 - '40 e nella chimica analitica dagli anni '70. Metodi semplici consentono di iniziare anche senza conoscenze molto specialistiche e H&S costosi Valore aggiunto: robustezza dei metodi e soluzione rapida e guidata dei problemi, accordo con le autorità regolatorie (meno variazioni) Necessità di condivisione tra tutte le funzioni aziendali, non è un approccio intra-laboratorio. N.B. Il Gruppo di Studio AFI Controllo di qualità e sviluppo analitico lavorerà sull'argomento nel 2013 – 2014.