ESERCITAZIONI ANTROPOLOGIA POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR)

RACCOLTA CAMPIONE BIOLOGICO Procedura per la raccolta di cellule della mucosa buccale Procedura per la raccolta saliva

ESTRAZIONE DEL DNA Diverse metodiche che variano per tempi e quantità di DNA estratto Fenol-cloroformio Salting out Kit di estrazione Salting out procedure

PREPARAZIONE DELLA PCR 1 – Campione di DNA 2 - Primers (filamenti di DNA sintetico che serve come punto di innesco per la replicazione del DNA) 3 – Nucleotidi 4 – Taq polimerasi (è un enzima per la polimerizzazione degli acidi nucleici. In particolare la Taq polimerasi proveniente dall'organismo termofilo Thermus aquaticus) 5 – Mix buffer (può variare in base al protocollo, nel nostro caso un tampone + MgCl2) 6 - Provette da PCR

REAZIONE PCR

ELETTROFORESI è una tecnica separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso

Caricamento dei campioni ELETTROFORESI Gel in cui sono stati praticati i pozzetti per la semina di campioni Caricamento dei campioni I campioni sono evidenziati agli UV La fluorescenza è ottenuta mediante una molecola intercalante capace di inserirsi nella doppia elica del DNA e di renderlo visibile agli UV (Cyber green)

UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR RFLPs restriction fragment length polymorphism, polimorfismo da lunghezza dei frammenti di restrizione Enzimi di restrizione Elettroforesi SEQUENZIAMENTO (SANGER) determinazione dell'ordine dei diversi nucleotidi che costituiscono l'acido nucleico. Elettroforesi mediante sequenziatore VNTR Variable Number of Tandem Repeat, Polimorfismi di lunghezza per le ripetizioni in tandem Elettroforesi mediante sequenziatore

UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR RFLPs L’enzima di restrizione o endonucleasi taglia il DNA in corrispondenza di una sequenza specifica. Se nella sequenza in questione un nucleotide muta, l’enzima non riconosce più la successione nucleotidica e non può tagliare la doppia elica

RFLPs Enzima di restrizione 300 bp 120 bp 180 bp 300 BP 180 BP 120 BP G C T A C G A T 120 bp 180 bp 300 bp 300 BP 180 BP 120 BP

UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR RFLPs

UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR SEQUENZIAMENTO ABI PRISM 310 Sequenziatore di DNA ABI Prism 3700

UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR SEQUENZIAMENTO Elettroferogramma

UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR VNTR Si definiscono VNTR sequenze costituite da unità di ripetizione molto corte (1-5 bp) disposte secondo una ripetizione in tandem GATA Unità di ripetizione 7 ripetizioni ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC 6 ripetizioni ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC 8 ripetizioni ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC

UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR GATA Unità di ripetizione Tracciato elettroforetico + 8 rip. Individuo 1 ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC 7 rip. 7 rip. ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC Individuo 2 ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC ATTAGCCCTCAGT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TTTAAAGTCCATC 5 rip Individuo 1 Individuo 2 -

UTILIZZO DEL DNA AMPLIFICATO TRAMITE PCR + Tracciato elettroforetico 8 rip. 7 rip. 7 rip. 5 rip Individuo 1 Individuo 2 -

UN ESEMPIO: DNA MITOCONDRIALE Molecola circolare di 16569bp 37 geni (13 proteine, 22 tRNA, 2rRNA) Regione codificante Regione di controllo (Hrv 1 e 2)

UN ESEMPIO: DNA MITOCONDRIALE APLOTIPO Combinazione di varianti alleliche lungo un cromosoma o segmento cromosomico contenente loci strettamente associati tra loro ATTTCCCCTAGGTAGA ATTTGCACTAGGCAGA Aplotipo 1 Aplotipo 2

UN ESEMPIO: DNA MITOCONDRIALE APLOGRUPPO gruppo di aplotipi di cui si ipotizza un’origine comune, grazie alla condivisione di mutazioni caratteristiche (generalmente ad evoluzione lenta) Aplogruppo mtDNA Si definisce sulla base della condivisione di mutazioni specifiche in posizioni con un basso tasso di mutazione (stabili) Aplotipi non identici possono appartenere allo stesso aplogruppo

UN ESEMPIO: DNA MITOCONDRIALE

UN ESEMPIO: DNA MITOCONDRIALE Sequenza di Anderson (1981) “sequenza di riferimento di Cambridge”

(MIX) QUANTITA’ PER CAMPIONE PROTOCOLLO PCR mtDNA (MIX) QUANTITA’ PER CAMPIONE H2O 19,5 μl Tampone 2,5 μl MgCl2 0,75 μl Nucleotidi (A-T-C-G) 0,5 μl Primer forward Primer reverse Taq polimerasi 0,25 μl 1) MOLTIPLICARE PER IL NUMERO TOTALE DEI CAMPIONI 2) DISPENSARE 24 μl DI MIX IN OGNI PROVETTA DA PCR 3) AGGIUNGERE 2 μl DI DNA AD OGNI PROVETTA DA PCR