Dipartimento di Scienze Chimiche Biocristallografia Lezione Introduttiva Antonello Merlino Dipartimento di Scienze Chimiche Stanza 1N10, Tel. 081674276 (269) antonello.merlino@unina.it

Eventuali riferimenti bibliografici Jan Drenth. Principles of Protein X-ray crystallography. Springer-Verlag (1994) G. A. Petsko and D. Ringe – Protein Structure and Function – New Science Press Ltd (2004) D. Blow – Outline of Crystallography for Biologists, Oxford University Press (2006) C. Branden and J. Tooze – Introduction to Protein Structure - 2nd Edition, Garland Publishing(1999)

Biologia Strutturale La Biologia mira alla comprensione di complessi processi biologici in cui intervengono molti componenti cellulari La Biologia Strutturale interpreta i processi biologici in termini di struttura tridimensionale delle macromolecole che partecipano a tali processi. La struttura tridimensionale viene descritta dalle posizioni di tutti gli atomi che costituiscono la macromolecola

Fundamental Questions How is a protein’s function defined by structure? What determines and mediates protein-protein and protein-membrane interactions? How does structure prescribe the binding affinity of a metal? How do protein cofactors modulate enzymes? 4

la contiguità dei residui in struttura determina la funzione Perchè è interessante studiare la struttura di una proteina ? l’analisi della struttura tridimensionale di una macromolecola può aiutarci a comprendere in quale modo e per quale motivo una determinata sequenza (avvolta in una specifica struttura) possa codificare una ben precisa funzione la contiguità dei residui in struttura determina la funzione

Dalla sequenza alla struttura VLSEGEWQLVLV . . . O2 Sequenza Struttura Funzione

Che informazioni offre la struttura? Conformazione dei siti attivi e di legame Orientazione dei residui conservati Interpretazione di meccanismi Visualizzazione di cavità Calcolo di potenziale elettrostatico …

Biologia strutturale studiati

Gli studi dei

How is a 3D structure determined ? 1. Experimental methods (Best approach): X-rays crystallography - stable fold, good quality crystals. NMR - stable fold, not suitable for large molecule. Electron diffraction Electron Microscopy Neutron diffraction 2. In-silico methods (partial solutions - based on similarity): Sequence or profile alignment - uses similar sequences, limited use of 3D information. Threading - needs 3D structure, combinatorial complexity. Ab-initio structure prediction - not always successful. 11

Spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) Permette di ottenere informazioni sulla struttura di una molecola attraverso l’interazione con una radiazione elettromagnetica. Si basa sullo stesso principio della risonanza magnetica usata in medicina, usa onde radio. I nuclei atomici (elettricamente carichi) ruotano, con una velocità angolare quantizzata, creando un momento magnetico  Immersi in un campo magnetico omogeneo esterno i momenti magnetici si allineano (“traballando” a causa del rumore termico). I nuclei vengono irradiati da onde radio (RF), l’effetto è di “disallineare”  (tanto da farli “ribaltare”). http://www.psrc.usm.edu/italian/nmr.htm http://www.fci.unibo.it/~montevec/nmr.htm http://w3.uniroma1.it/centricnr-cscson/annibale/NMR1.doc È possibile rilevare quando i momenti magnetici dei vari nuclei (che continuano a ruotare) si inclinano completamente sul piano perpendicolare rispetto al campo magnetico applicato grazie ad un'antenna che capta le onde radio che questi generano ed è collocata perpendicolarmente al campo magnetico applicato. 15

Spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) Ogni nucleo mostra le sue caratteristiche perchè ruota a velocità differente a seconda della sua posizione nella molecola e all'ambiente che gli atomi vicini gli fanno sentire e quindi risuona a frequenze radio diverse. Nuclei diversi risuonano a frequenze diverse. Ciò significa innanzitutto che un atomo di carbonio deve essere colpito da un'onda radio con frequenza diversa da quella necessaria ad un atomo di idrogeno per “ribaltarsi” di 90°, ma anche che atomi simili in ambienti diversi, come un atomo di idrogeno legato ad un atomo di ossigeno ed un atomo di idrogeno legato ad un atomo di carbonio si ribaltano a frequenze diverse. Questo è dovuto alla “schermatura” degli elettroni vicini Caratteristiche: studio delle proteine in soluzione (non occorre cristallizzarle) alta risoluzione temporale (millisecondi) informazioni sulle distanze interprotoniche non precise la “proton signature” limita il metodo allanalsi di molecole “piccole” (<30 KD  <250 residui) informazioni su strutture di complessi proteici deducibili solo con il ricorso a metodi di modellistica guidati dai dati sperimentali http://www.psrc.usm.edu/italian/nmr.htm http://www.fci.unibo.it/~montevec/nmr.htm http://w3.uniroma1.it/centricnr-cscson/annibale/NMR1.doc 16

NOE (Nuclear Overhauser Effect) NMR Campo magnetico NOE (Nuclear Overhauser Effect)

Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Proteine in soluzione Limite di dimensione ~ 40 kDa Proteine stabili a lungo Marcatura con 15N, 13C, 2H. Strumentazione molto costosa Tempo per assegnare le risonanze

Tecniche per lo studio della struttura delle macromolecole biologiche Cristallografia a raggi X il problema e’ ottenere il cristallo Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) il problema e’ la dimensione (£ 30-50 kD) Microscopia elettronica e’ limitata ai casi in cui si possano ottenere cristalli bidimensionali molto grandi Homology Modelling per proteine con > 30-50% identità

Experimental Determination of Atomic Resolution Structures X-ray X-rays Diffraction Pattern Direct detection of atom positions Crystals NMR RF Resonance H0 Indirect detection of H-H distances In solution 24

Protein structures in the PDB The last 15 years have witnessed an explosion in the number of known protein structures. How do we make sense of all this information? blue bars: yearly total red bars: cumulative total 25

Number of released entries Update - done Year

Crescita Annuale di Strutture Determinate Tramite Diffrazione di raggi x su cristalli singoli

Crescita Annuale di Strutture Determinate Tramite NMR

Crescita Annuale di Strutture Determinate Tramite Microscopia elettronica

Swiss-Prot + TrEMBL 700.000 sequenze i metodi sperimentali per la determinazione della sequenza di una proteina sono estremamente rapidi (l’ordine di grandezza è il giorno) e relativamente economici la risoluzione della struttura tridimensionale di una proteina richiede invece l’uso di strumenti più complessi, e talvolta mesi di lavoro Swiss-Prot + TrEMBL 700.000 sequenze PDB (Protein Data Bank) 76.000 strutture gran parte delle ricerche in biologia strutturale è quindi volta allo studio delle leggi fondamentali del folding delle proteine e la biologia computazionale dedica molte energie e risorse allo sviluppo di metodi per la predizione della struttura delle proteine

Comparison of Experimental Approaches for Structure Determination Fundamental differences: NMR sees substantially Hydrogen atoms. Crystallography sees all atoms except Hydrogen. NMR explicitly determines distances between Hydrogen atoms. Crystallography implicitly determines distances between all other atoms. NMR only determines distances for atoms that are close to each other. Crystallography is best at (implicitly) determining distances between atoms that are far apart. NMR structures are usually represented as an ensemble. Crystal structures are usually represented as a single average structure.

X-ray Crystallography NMR Advantages and Disadvantages of Using NMR/X-ray Crystallography to Determine Macromolecular Structures X-ray Crystallography Advantages: • No size limit. • Structures can be very precise (coordinate error ~0.1 Å for high resolution data). • Can be faster. Disadvantages: • You have to grow crystals (~50% don’t) • Electron density is the average for all molecules in the crystals over the time of the data collection • Structure may be influenced by the crystal lattice. NMR Disadvantages: • Effective size limit of 35 kDa. • Structures are typically less precise than those of very high resolution crystal structures (backbone coordinate error is typically 0.5-1Å vs mean). Advantages: • You don’t have to grow crystals. • You can use NMR to look at dynamic processes. • You are determining the structure of the protein in solution. • Detects multiple conformations.

Pro e contro X-ray NMR Richiede cristalli, problematico Non ha limiti (teorici) di grandezza Piú preciso Risoluzione Struttura può essere deformata dai cristalli, rigida Una “soluzione“ NMR Possibile in soluzione, più semplice Limitato a proteine fino a circa 300 residui Meno preciso Numero di vincoli Struttura nativa in soluzione, flessibile Molti modelli

X-ray NMR

Cristallografia La Cristallografia studia l’assetto strutturale dei composti solidi naturali e di sintesi (cristallografia strutturale); descrive le relazioni tra composizione chimica e struttura (cristallochimica), nonché le trasformazioni strutturali indotte dalle variazioni di temperatura e pressione; consentendo l’acquisizione della comprensione delle proprietà e del comportamento dei solidi cristallini.

Cristallografia a Raggi X La cristallografia a raggi X è la scienza che permette di determinare la disposizione degli atomi di una molecola in un cristallo a partire dal modo in cui i raggi X sono diffratti dal cristallo.

Biocristallografia La cristallografia a raggi X misura la densità degli elettroni all’interno del cristallo, da cui si possono dedurre le posizioni atomiche. Scopo della biocristallografia a raggi X: determinazione della struttura tridimensionale di macromolecole biologiche a risoluzione atomica (coordinate x,y,z per ciascun atomo che costituisce la macromolecola biologica). Macromolecole biologiche oggetto dello studio: DNA, RNA, proteine e loro complessi (virus, ribosoma, ecc.). Le proteine più piccole sono costituite da ben oltre 1000 atomi e le proteine più grandi possono essere costituite da 104 a 105 atomi.

Biocristallografia Applicazioni La conoscenza della struttura 3D di una macromolecola consente di capire i processi biologici e di eseguire studi funzionali a risoluzione atomica (Å) - interazioni fra macromolecole - interazioni fra macromolecole e piccole molecole (substrati, cofattori, inibitori, ioni, ecc.) - studi struttura-funzione su enzimi - sviluppo di farmaci - applicazioni biotecnologiche

Passato e presente La prima struttura cristallografica di una proteina fu quella della mioglobina di capodoglio, determinata da Max Perutz e Sir John Cowdery Kendrew nel 1958, per la quale essi ricevettero il premio Nobel per la Chimica nel 1962. La biocristallografia a raggi X è, a tutt’oggi, la disciplina più prolifica nell’ambito della biologia strutturale: delle ∼75000 strutture tridimensionali di proteine attualmente note, ∼85% sono state determinate tramite la cristallografia a raggi X. Genomica strutturale: è la nuova frontiera della biocristallografia a raggi X.

Cenni storici 1864 Viene cristallizzata l’ emoglobina. 1912 Facendo attraversare dai raggi X un cristallo di solfuro di zinco Von Laue ottiene i primi diffrattogrammi. W.L. Bragg e W.H. Bragg propongono una correlazione semplice tra la figura di diffrazione ottenuta con i raggi X e la disposizione degli atomi nel cristallo che ha generato la figura (legge di Bragg). Anni ‘30 Bernal, Crowfoot, Bragg, ottengono i primi diffrattogrammi da cristalli di proteine (insulina, emoglobina, mioglobina). 1941 Atsbury ottiene il primo diffrattogramma ai raggi X del DNA. 1951 Pauling e Corey propongono la struttura di a-elica e foglietto b in base a considerazioni teoriche. 1953 Watson e Crick propongono la struttura a doppia elica del DNA sulla base delle analisi diffrattometriche ai raggi X di Franklin e Wilkins. 1954 Perutz e coll. elaborano i metodi basati sull’ impiego dei metalli pesanti per risolvere il problema delle fasi nella cristallografia ai raggi X. 1960 Kendrew descrive la struttura della mioglobina a una risoluzione di 2 Å. Perutz propone la struttura della emoglobina, piu’ grande, ad una risoluzione inferiore. Anni ‘80 Hartmut Michel risolve la struttura (3 Å) della prima proteina di membrana (centro di reazione fotosintetico). 2000 Vengono risolte le strutture (3 Å) delle subunita’ L e S del ribosoma (circa 1.5 e 1 MDa rispettivamente).

First Protein Structure Myoglobin. Protein purified from whale blood. Max Perutz 1958. Showed a 75% a-helical fold. 155 amino acids, ~ 17 kDa.

1953: Double helix structure of DNA Crick & Watson used X-ray diffraction to work out the way genes are encoded.

Diffraction pattern. Crystals & diffraction pattern recorded by Rosalind Franklin. Revealed the symmetry of the helix & pitch of helix.

Osservazioni esterne: un esempio “storico” 1953: Watson&Crick risolvono la struttura del DNA cristallino combinando informazioni chimiche (composizione, densità, stereochimica, e soprattutto le regole di Chargaff) e informazioni cristallografiche (dimensioni di cella e presenza di forme elicoidali). Approccio già impiegato da Pauling per la risoluzione dell’a-elica. R. Franklin e M. Wilkins non risolvono la struttura del DNA (pur ottenendo informazioni essenziali) perché impiegano un approccio puramente cristallografico. I metodi allora disponibili (mappa di Patterson) non potevano consentire di decifrare l’enigma (almeno in tempi rapidi).

First Protein Complex Hemoglobin. Two copies each of a & b chains of myoglobin in a complex. Solved by John Kendrew.

Structure of Nucleic Acid & Protein complex. Nobel prize to Aaron Klug in 1982. Also contribution to electron microscopy.

Photosynthetic Reaction Centre Structure. First membrane protein structure in 1985. Nobel prize to Michel, Deisenhofer & Huber 1988. Showed the technique of detergent solubilised membrane protein crystallisation.

Structure of F1-ATPase Revealed the details of the rotational mechanism of ATP-synthase. Nobel prize in 1997.

Structure of the K+ channels Revealed the structural basis for ion transport across a membrane. Deep physiological relevance. Nobel prize in Chemistry 2003 to Roderic MacKinnon.

Structure of TBSV First Virus structure, tomato bushy stunt virus, 1978. By Steve Harrison. Revealed icosohedral symmetry of a virus particle.

Ribosome 50 S and 70 S ribosome structures in 2000. Massive RNA:Protein complexes. Revealed details of how proteins synthesyzed by RNA. Nobel prize to Yonath, Steiz, Ramakishnan in 2009

“The next step beyond the human genome project” Structural Genomics “The next step beyond the human genome project” “These studies should lead to an understanding of structure/function relationships and the ability to obtain structural models of all proteins identified by genomics. This project will require the determination of a large number of protein structures in a high-throughput mode.”