La proteina nella chimica analitica SICSI VIII Ciclo A.A. 2008/2009 Corso di Laboratorio di Chimica Analitica La proteina nella chimica analitica Prof. S. Andini

Prerequisiti e finalità Questo modulo si rivolge a studenti di 4°anno istituto tecnico industriale Quello che già sanno Gli studenti già hanno affrontato la chimica generale e fondamenti di chimica organica. Conoscono le proteine grazie al corso di chimica della natura. Spettroscopia, legge Lambert-Beer Quello che impareranno Che si può imitare la natura per quantizzare una sostanza di interesse in un miscuglio. La chimica analitica si può avvalere di tutti gli indirizzi della chimica: inorganica, organica, biologica e fisica.

Le proteine richiamo ad alcune nozioni Sono costituite dai 20 L-amminoacidi Hanno una struttura primaria, secondaria, terziaria e quaternaria Hanno diverse funzioni all’interno della cellula: strutturale o funzionale.

Le proteine come catalizzatori biologici: gli enzimi alla fine della reazione, le proteine enzimatiche devono conservare la loro struttura immodificata e pronta per riprendere l’attività catalitica devono essere efficaci in piccole quantità 3. non devono influenzare l’equilibrio di una reazione chimica reversibile: la costante di equilibrio è una costante termodinamica caratteristica della reazione 4. devono mostrare specificità nella capacità di accelerare le reazioni chimiche

Schematizzando S+E ES E+P Esiste una relazione quantitativa tra la concentrazione del substrato [S] e la velocità della reazione enzimatica: S+E ES E+P K1 K2 K-1 Equazione di Michaelis - Menten Km = (K2 + K-1) / K1 un solo substrato

Come si misura l’attività di un enzima Misura della velocità di formazione del prodotto O Misura della velocità di scomparsa del reagente

Preliminari Preparare l’enzima Preparare il substrato Preparare il mezzo adatto Procurarsi un metodo per la misura del parametro “tempo” Procurarsi un metodo che quantifichi la formazione del prodotto o la scomparsa del substrato nell’unità di tempo

tipi di saggi Saggio discontinuo (stop and sample): La reazione viene stoppata a tempi diversi: A tempo t0, t1, t2,….tn vengono prelevati delle aliquote e misurate le concentrazioni di prodotto o reagente

tipi di saggi Saggio con misura in continuo: La reazione enzimatica può essere seguita per via spettroscopica: Si segue l’aumento o la diminuzione, in continuo, di un’assorbanza ad una determinata lunghezza d’onda

Esempio di saggio stop and sample Reazione dell’esocinasi: Glucosio + ATP Glucosio-6P + ADP Non ci sono composti con cromofori che possono essere rilevati spettroscopicamente!!!

Reazione dell’esocinasi saggio stop and sample A tempo t0, t1, t2,….tn vengono prelevati delle aliquote e misurate le concentrazioni di prodotto o reagente dopo averlo separato dalla miscela di reazione, per es per cromatografia. Svantaggi: La quantificazione dei composti separati è laboriosa (bisogna mettere a punto la tecnica, standardizzare) Errori di manualità (prelievi a tempi ristretti) C’è bisogno di notevoli quantità di campione perché il substrato o il prodotto possano essere dosati

Per es: la reazione della glucosio 6-fosfato deidrogenasi (G6PD) Soluzione: Si può accoppiare la reazione ad una che può essere seguita spettroscopicamente: Per es: la reazione della glucosio 6-fosfato deidrogenasi (G6PD)

Non c’è bisogno di fare prelievi Non bisogna stoppare la reazione Saggio in continuo: Glucosio + ATP Glucosio-6P + ADP Glucosio-6P + NADP+ 6-fosfogluconato + NADPH Si valuta la comparsa di NADPH a 340nm La concentrazione di NADPH sarà proporzionale alla concentrazione di Glucosio-6P prodotto dall’esocinasi esocinasi G6PD Vantaggi: Non c’è bisogno di fare prelievi Non bisogna stoppare la reazione

Spettro di assorbimento del NADPH Forma ossidata Forma ridotta NAD+ (NADP+) NADH (NADPH) Nicotinammide Mononucleotide (NMN) monofosfato Adenosin (AMP)

Una volta calcolata la velocità si può usare uno dei seguenti parametri nella valutazione dell’attività di un enzima

Applicazioni per la chimica analitica

Quantizzazone di un metabolita

Le proteine come selezionatori: gli anticorpi Il legame antigene-anticorpo: Nella cellula serve per riconoscere il “se” o l’estraneo (risposta immunitaria) Anticorpo Antigene

Una tecnica immunologica: l’ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) Tipi di ELISA Questa tecnica mima l’interazione fra due proteine che si riconoscono in modo specifico e complementare: l’antigene e l’anticorpo

Cosa serve

Applicazioni per la chimica analitica

Calcolo della concentrazione di IL-2 in tre campioni biologici 7,5 15 30 60 1-Standard B 7,5 15 30 60 2-Campione 3-Ab coniugato

Retta di taratura