Enzimi come catalizzatori biologici.   Gli enzimi sono molecole proteiche aventi il compito di catalizzare praticamente tutte le reazioni chimiche che avvengono negli organismi viventi. Essi svolgono il loro ruolo con modalità differenti da reazione a reazione, ma in tutti i casi la catalisi procede attraverso la formazione di complessi tra l'enzima e i reagenti. La più semplice reazione catalizzata da un enzima può essere così rappresenta da: E + S <====>ES <====>EP <====> E + P L'enzima si combina con l'unico reagente S, detto substrato, per formare un complesso enzima-substrato, ES. ES è poi trasformato in EP che si scinde in prodotto P ed enzima libero, che è nuovamente disponibile per reagire con un'altra molecola di S. Il processo può avvenire in maniera estremamente rapida: in molti casi una sola molecola di enzima è in grado di trasformare in 1 secondo migliaia di molecole di substrato in prodotto. La velocità di una reazione catalizzata da un enzima può essere fino a 1014 volte superiore alla velocità della stessa reazione non catalizzata.

La struttura degli enzimi. Gli enzimi sono generalmente proteine globulari che in soluzione assumono approssimativamente una conformazione sferica. Il loro peso molecolare può variare da 10.000 a milioni di Dalton. Nei casi più semplici la molecola enzimatica è formata da una singola catena polipeptidica contenente un centinaio di residui amino acidicí. In quelli più complessi, più catene polipeptidiche sono aggregate tra loro. La disposizione tridimensionale della catena polipeptidica (la cosiddetta struttura terziaria) è alquanto specifica: i singoli residui aminoacidici si vengono a trovare in posizioni ben definite, posizioni che sono indispensabili per l'attività biologica dell'enzima. La struttura terziaria di una catena polipeptidica appartenente ad enzimi costituiti da più catene, costituisce una sottostruttura, in quanto le catene non si compenetrano l'una alle altre, ma formano delle sottounità indipendenti che si aggregano nella forma oligomerica (struttura quaternaria). Studi di diffrazione ai raggi X di enzimi in forma cristallina forniscono dettagliate informazioni sulla disposizione degli atomi all'interno di una molecola enzimatica: possono essere messe in evidenza interazioni tra gruppi polari (particolarmente frequenti i legami idrogeno) ed interazioni tra gruppi idrofobici che sono responsabili della formazione di zone ordinate all'interno della molecola. Oltre a ciò è possibile determinare le interazioni che si instaurano tra l'enzima e il substrato, cosa questa che ci permette di asserire l'origine chimica dell'effetto catalitico. Alcuni enzimi esplicano la loro funzione catalitica utilizzando esclusivamente la reattività chimica dei loro residui aminoacidici. Molti enzimi richiedono invece la partecipazione di cofattori che non sono parte della struttura proteica. Questi cofattori sono spesso legati saldamente, anche covalentemente, all'enzima e possono essere ioni metallici o complesse molecole organiche. Se il cofattore viene rimosso, la proteina assume il nome di apoenzima che è privo di attività.

Flessibilità degli enzimi. Una proprietà importante degli enzimi è che la loro struttura non è rigida ma flessibile. L'origine di queste proprietà va ricercata nella relativa debolezza delle interazioni idrofobiche e ioniche responsabili della specifica conformazione spaziale delle catene polipeptídiche. L'associazione di residui idrofobici avviene in quanto questi si sequestrano dall'ambiente acquoso rifugiandosi nelle porzioni interne della molecola, ove i contatti con l'acqua sono minimizzati. Le interazioni ioniche comprendono legami salini tra gruppi di carica opposta e legami idrogeno. Quando questi ultimi sono formati tra gruppi della catena polipeptidíca esposta all'acqua, questo va a scapito dei legami idrogeno che gli stessi gruppi instauravano con le molecole d'acqua. I nuovi legami sono instabili e facilmente si rompono per restaurare i legami con l'acqua. Più stabili sono invece i legami idrogeno che si formano nelle regioni idrofobiche, ove un processo di scambio con l'acqua non esiste. Data la relativa instabilità dei legami in gioco nella determinazione della struttura specifica di una proteina, è ragionevole supporre che la proteina non assuma una singola struttura fissa, ma che esista in una miscela di forme in equilibrio tra loro (forme tautomeriche), che sia cioè non una struttura rigida, ma flessibile. Qualora un substrato si leghi preferibilmente con una sola di queste forme, essa prevarrà sulle altre. Si parla in questo caso di un cambiamento strutturale indotto, che si ripercuote di solito positivamente sull'attività catalitica. La flessibilità è importante per favorire l’accesso dei ligandi ai siti attivi con successiva formazione di complessi con l'enzima.

Il complesso enzima-substrato. L'idea che il meccanismo chimico della catalisi enzimatica comprenda la formazione di un complesso enzima-substrato fu suggerito agli inizi del secolo per spiegare il comportamento cinetico dell' invertasi. La prova diretta dell'esistenza di un simile complesso si è potuta avere solo con l'introduzione di tecniche spettroscopiche. E' in questo modo che nel 1943 fu dimostrata l'esistenza di un complesso tra perossidasi ed acqua ossigenata. Da allora tecniche di spettrometria di assorbimento e di fluorescenza sono state utilizzate nello studio di complessi di enzimi che usano coenzimi nucleotidici e flavinici; mentre la risonanza magnetica è stata utilizzata nello studio di complessi di enzimi contenenti ioni metallici. L'isolamento di complessi enzima-substrato è stato possibile solo in pochi casi, e solo quando il legame tra enzima e substrato è di natura covalente. Per comprendere le modalità di azione di un enzima è necessario conoscerne non solo la struttura allo stato nativo, ma anche le strutture dei complessi con il substrato, l’ intermedio ed il prodotto. Solo così sarà possibile studiare quali gruppi catalitici si trovino in prossimità del substrato e quali cambiamenti strutturali si verifichino nell’ enzima e nel substrato quando vengano tra loro in contatto.

Il sito attivo. La maggior parte delle reazioni enzimatiche utilizza substrati che sono di piccole dimensioni se comparati alla molecola enzimatica. Di conseguenza solo una piccola parte della proteina enzimatica si trova a diretto contatto con la molecola del substrato a formare il COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO (ES). Le porzioni di enzima a contatto con il substrato che giocano un ruolo diretto nel processo catalitico costituiscono il cosidetto SITO ATTIVO (o CATALITICO). Il resto della proteina enzimatica fornisce una specie di scheletro strutturale che garantisce il mantenimento dei componenti del sito attivo nella conformazione tridimensionale necessaria ad una efficiente e specifica catalisi. Tutti gli enzimi presentano il fenomeno della specificità di substrato. Ai livelli più elevati di specificità, gli enzimi non solo sono in grado di discriminare in base all’ identità chimica del substrato, ma anche sulla base della sua configurazione geometrica e stereochimica. Ad esempio se un enzima utilizza come substrato la forma D di uno zucchero, ne consegue che il corrispondente stereoisomero L non sarà oggetto di reazione, se non in misura del tutto trascurabile. Gli enzimi possono distinguere due gruppi uguali all'interno di una molecola simmetrica in modo da reagire sempre con lo stesso gruppo. E' il caso dell'enzima aconitasi che catalizza la trasformazione dell'acido citrico in cis-aconitico.

Il concetto stesso di specificità richiede che l'enzima e il substrato si adattino l'un l'altro. Nel 1894 Fischer propose la sua "ipotesi della serratura e della chiave" (lock and key hypothesis) implicante una complementarietà tra substrato ed enzima legata a rigide conformazioni molecolari.

Modello della serratura e della chiave. Per quanto questa ipotesi sia in grado di spiegare le interazioni enzima substrato per un gran numero di enzimi, diviene difficilmente sostenibile quando si consideri che composti chimicamente molto simili al substrato ma che posseggono gruppi meno voluminosi spesso non reagiscono con l'enzima, sebbene dovrebbero facilmente adattarsi allo stampo rappresentato dal sito attivo. Ad esempio l'enzima 5’-nucleotidasi idrolizza il ribosio 5-fosfato ad un centesimo della velocità osservata quando lavori sul suo substrato,l’acido adenilico. E' sulla base di queste osservazioni che Koshland (1958) dedusse che la più larga struttura del vero substrato è indispensabile per far funzionare l'enzima in maniera completa, in quanto in grado di orientare i gruppi catalitici dell'enzima nella corretta posizione nei confronti dei gruppi reagenti del substrato. L'ipotesi di Koshland va sotto il nome di "ipotesi dell'adattamento indotto" (induced fit) e si basa su di una potenziale complementarietà dell'enzima e del substrato, paragonabile alla complementarietà esistente tra una mano e un guanto, più che tra una serratura ed una chiave.

A) Modello dell’ adattamento indotto: enzima e substrato si modificano a vicenda. B) Modello dell’ adattamento indotto: in alcune in reazioni a due substrati solo il cambiamento conformazionale indotto nell'enzima dal legame con il primo substrato permette al secondo substrato di legarsi.

La catalisi enzimatica

Gli enzimi sono proteine specializzate nel catalizzare le reazioni biologiche. Gli organismi viventi sono caratterizzati da un ribollire di attività metabolica

Classificazione sistematica degli enzimi secondo la “Enzyme Commission” 1 Ossidoreduttasi Trasferimento di elettroni (ioni idruro o atomi di H) 2 Trasferasi Trasferimento di gruppi funzionali 3 Idrolasi Reazioni di idrolisi 4 Liasi Addizioni a doppi legami 5 Isomerasi Trasferimento di gruppi all’interno di una molecola con produzioni di forme isomere 6 Ligasi Formazione di legami mediante reazioni di condensazione accoppiate all’idrolisi di ATP ureasi E.C. 3.5.1.5

+ cofattori ioni metallici coenzimi coenzima enzima biotina alcol deidrogenasi flavin adenina dinucleotide catalasi nicotimammide adenina dinucleotide perossidasi Ione enzima Fe2+ o Fe3+ citocromo ossidasi Mg2+ esochinasi Ni2+ ureasi Da un punta di vista strutturale gli enzimi possono essere divisi in a)enzimi semplici, che nella loro struttura presentano solo molecole di natura aminoacidica e la loro attività come catalizzatori dipende solo dalla loro struttura proteica b) enzimi complessi quando come prodotto di idrolisi si formano, oltre agli aminoacidi, anche uno o due componenti di natura diversa da quella aminoacidica, che vengono chiamati cofattori. In questo caso, la loro attività catalitica dipende anche dalla presenza di tali componenti. ioni metallici + cofattori coenzimi

Gli enzimi non cambiano la Keq il DG°’ una reazione non spontanea in una spontanea non cambiano la costante di equilibrio della reazione. Keq dipende solo dalla differenza del livello di energia tra reagenti e prodotti. non cambiano il DG°’ della reazione. Gli enzimi abbassano solo l’energia di attivazione, ma non la differenza di energia tra reagenti e prodotti non convertono una reazione non spontanea in una spontanea C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 +6H2O DG°’= -2870 kj

specificità substrati reazioni complementarietà strutturale mutuo riconoscimento

modulazione dell’attività quantità di proteina enzimatica regolazione

Richiami di Cinetica Chimica Per la reazione  A  P la velocità è La definizione e l'individuazione degli stadi intermedi compresi nel processo complessivo della reazione costituiscono la descrizione del meccanismo della reazione. Il termine cinetica enzimatica implica uno studio della velocità di una reazione catalizzata da enzimi e dei vari fattori che possono influenzarla. Al cuore di ogni studio di enzimatica sta la conoscenza del modo in cui viene cambiata la velocità di reazione attraverso il cambiamento di concentrazione del substrato dell'enzima e dell'apparato matematico sottostante. Per facilitarci il compito assumeremo che l'enzima in discussione non ha particolari proprietà come propietà allosteriche e che catalizza la reazione che da un solo substrato porta ad un solo prodotto. Questo potrà sembrare un caso tutt'altro che reale, dal momento che dopo tuttosono pochi enzimi ad avere un solo substrato, ma ci fornirà uhna base che potremmo allargare in seguito allorchè affronteremo lo studio di sistemi più complessi.

Reazione chimica non catalizzata ci aspetteremmo che la velocità di reazione sia direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato, cioè al raddoppio della concentrazione del substrato raddoppierebbe pure la velocità. Ciò è dovuto ad un fatto puramente statistico, in quanto con il raddoppio delle molecole totali raddoppiano anche le molecole che hanno energia utile. In questo caso si ha una linea retta in un grafico velocità vs concentrazione. V= k [A]

Diagramma energetico di una reazione chimica Stato di transizione Energia libera, G Variazione totale dell’energia libera della reazione A Una reazione di tipo SP ha luogo perché una certa frazione della popolazione di molecole S, a ogni istante, possiede molta più energia che il resto della popolazione. L’energia è sufficiente a raggiungere uno stato attivato in cui si possa formare o rompere un legame chimico per dare il prodotto P. L’energia di attivazione è la quantità di energia in cal necessaria per portare allo stato attivato tutte le molecole di 1 mole di una sostanza a una data temperatura. In tutte le reazioni c’è uno stato di transizione definito come lo stato ricco di energia delle molecole che interagiscono alla sommità della barriera di attivazione. Stato basale P Stato basale Coordinata di reazione

Diagramma energetico di una reazione chimica catalizzata Coordinata di reazione Energia libera, G Stato di transizione Gli enzimi - non cambiano la costante di equilibrio della reazione. Keq dipende solo dalla differenza del liuvello di energia tra reagenti e prodotti. -non cambiano il DG della reazione. Gli enzimi abbassano solo l’energia di attivazione, ma non la differenz adi energia tra reagenti e prodotti -non convertono una reazione non spontanea in una spontanea

Il sito attivo Esiste una zona specifica o ambiente nella struttura tridimensionale dell'enzima in cui si creano le condizioni favorevoli microambientali. Tale zona o tasca dell'enzima viene definita sito attivo ed in esso va a legarsi il substrato per formare il complesso ES. Nel sito attivo dell'enzima esistono gruppi funzionali specifici che hanno una funzione catalitica. Essi reagiscono temporaneamente con un substrato e lo predispongono alla trasformazione in prodotto. La formazione del complesso ES si basa su un meccanismo di riconoscimento mediato da precisi requisiti chimici e strutturali posseduti sia dall'enzima che dal substrato.

Cinetica Enzimatica V [S] La velocità iniziale di una reazione aumenta quasi linearmente all'aumentare della concentrazione di substrato. V La velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato e la reazione è di primo ordine V = k [S] [S]

Cinetica Enzimatica Vmax V La proporzionalità fra V e [S] progressivamente diminuisce. Vmax V La velocità iniziale diventa indipendente dalla [substrato] e la reazione è di ordine zero rispetto al substrato. All’aumentare della concentrazione di substrato la proporzionalità fra V e [S] progressivamente diminuisce, e si registrano solo minimi incrementi di velocità anche per elevate variazioni della concentrazione di substrato. Il valore della velocità misurato in queste condizioni viene detto velocità massima o Vmax. [S]

L'Equazione di Michaelis-Menten E + S ES E + P k1 k-1 k2 assunzione dello stato stazionario la variazione della concentrazione di ES nel tempo t è zero Le due variabili nell'equazione sono v e la concentrazione del subsrato, mentre V e Km sono due costanti che richiedono ulteriori informazioni. Perchè la curva v/[substrato] ci dia informazioni sulle proprietà dell'enzima e il modo in cui risponde al suo ambiente nella cellula, abbiamo bisogno di comprendere le basi matematiche sottostanti.                                    

L'Equazione di Michaelis-Menten E + S ES E + P k1 k-1 k2 [E] = [ET] - [ES] vf = k1([ET]-[ES]) [S] vs = k-1[ES] + k2 [ES] = (k-1 + k2)[ES] vf = vs per lo stato stazionario k1([ET]-[ES]) [S] = (k-1 + k2)[ES] = KM

Equazione di Michaelis-Menten riarrangiando poiché v = k2 [ES] Quando [S]>>[ET] [ET]=[ES] e v = Vmax Vmax = k2 [ES] max Equazione di Michaelis-Menten

Come si ricavano Vmax e KM La Vmax o velocità limitante della reazione si può ricavare sperimentalmente da una curva di saturazione da substrato. V/2 = 5 velocità La KM è definita come la concentrazione del substrato che causa una velocità uguale alla metà di quella massima.      La pendenza del grafico diviene sempre minore con l'aumentare di [substrato] e perciò ci deve essere un valore massimo di velocità che non potrà mai superare indipendentemente da quanto grande diventa la concentrazione del substrato. Enzymes react distinctively to alteration in the concentration of reacting molecules. At very low substrate concentration, collisions between enzyme and substrate molecules are infrequent and reaction proceeds slowly. As the substrate concentration increases, there reaction rate initially increases proportionately as collisions between enzyme molecules and reactants become more frequent Figure 3. When the enzymes begin to approach the maximum rate at which they can combine with reactants and release products, the effects of increasing substrate concentration diminish. At the point at which the enzymes are cycling as rapidly as possible, further increases in substrate concentration have no effect on there reaction rate. At this point the enzyme is saturated and the reaction remains at the saturation level. If the reaction reaches a point at which further increases in reactants have no effect in increasing the rate of the reaction, then there is a good chance that the reaction is catalyzed by an enzyme. Uncatalyzed reactions, in contrast, increase the rate rate of the reaction almost indefinitely as the concentration of reactants increases. KM =4 [substrato]

La costante di Michaelis (KM) affinità La KM ci dà informazioni sulla forza di legame substrato enzima o come viene chiamata affinità. Tra affinità e KM c'è una relazione inversa: alta affinità è data da un basso valore di KM. Bassa affinità è data da un alto valore di Km.

Effetti della concentrazione dell’enzima Raddoppiando le molecole di enzima avremmo il doppio di molecole di substrato legate all'enzima e ci si aspetterebbe un raddoppio della velocità, come è in realtà: Vmax è direttamente proporzionale alla [E] Km è indipendente dalla [E] e dalla [S]

kcat o numero di turnover Unità Internazionale la quantità di enzima che catalizza la formazione di una micromole di prodotto in un minuto kcat o numero di turnover il numero di molecole di substrato convertite in prodotto nell'unità di tempo da una molecola di enzima quando è saturata con il substrato. La concentrazione dell’enzima può essere espressa in termini di attività osservata.

kcat kcat kcat kcat kcat E + S ES E + P kcat = k2 Vmax = kcat [ET] attività molecolare La costante di velocità indicata come kcat identifica la costante della tappa limitante la velocità della intera reazione Se una reazione si verifica secondo un meccanismo a due stadi come quello previsto da Michaelis-Menten E’ una costante di primo ordine ed è espressa in s-1 . efficienza catalitica

Enzima kcat catalasi 40 000 000 anidrasi carbonica 1 000 000 acetilcolinesterasi 14 000 lattato deidrogenasi 1 000 chimotripsina 100 DNA polimerasi 15 lisozima 0,5

Grafico di Michaelis-Menten V max [S]

Equazione di Lineweaver-Burk Linearizzazione dell’equazione di Michaelis-Menten Equazione di Lineweaver-Burk M

Grafico di Eadie-Hofstee V [S] Vmax Pendenza = -KM KM

Che cosa influenza la velocità della reazione? Temperatura, °C Velocità di reazione TEMPERATURA Velocità di reazione pH Pepsina Chimotripsina Tripsina pH A number of external factors affect the activity of enzymes in speeding conversion of reactants to products. These factors, including variations in the concentration for substrate molecules, temperature, and pH, speed or slow enzymatic activity in highly characteristic patterns. A higher temperature generally results in an increase in enzyme activity. As the temperature rises, the movement of enzyme molecules and substrate molecules increases. This causes more collisions between enzyme and substrate and the net result is the formation of more product. If the temperature rises beyond a certain point, however, the enzyme activity eventually levels out and then declines rapidly because the enzyme is denatured by heat. The enzyme shape change during denaturation and can not catalyze the reaction and there is shape drop in the rate of the reaction with change in temperature. The effect of pH on Enzyme Activity A change in pH can also effect enzyme activity. Each enzyme has an optimal pH range that help maintain its normal configuration in an environment which it operates. Pepsins is a proteolytic enzyme found in the stomach and functions at pH 2. At pH 2 the tertiary structure of pepsin is not altered and will catalyze the reaction. Trypsin is and enzyme found in the small intestine and prefer a pH of about 8. The tertiary structure of a protein depends on interactions such as hydrogen bonding, between R groups. A change in pH can alter the ionization of these side chains and disrupt the normal configuration and in some case denature the enzyme. A denatured protein can not combine with a substrate.

Inibitori enzimatici Irreversibili Reversibili Gli inibitori sono composti che interagendo con l'enzima ne riducono la sua velocità di reazione. Si trovano naturalmente nelle cellule, dove controllano la velocità di reazione dei processi metabolici, o introdotti artificialmente nei processi come strumenti sperimentali. Molti composti tossici sono inibitori enzimatici e perciò causano un'inibizione dei processi vitali complessivi. Il modo di interagire con l'enzima è estremamente vario e lo studio dei processi cinetici ci permette di delucidare i vari meccanismi.

Inibizione Competitiva Inibizione competitiva per formazione di legami col sito attivo                                                                                                                                                                                          Da un punto di vista classico un inibitore competitivo è un composto che ha una stretta somiglianza strutturale e chimica col substrato. Questa somiglianza lo fa legare al sito attivo al posto del substrato. mutuamente escludenti

Inibizione non competitiva Inibizione competitiva per cambiamento di conformazione L'inibitore non si lega al sito attivo ma in un'altra zona dell'enzima tipica per quell'inibitore, che è localizzata in una porzione diversa dell'enzima stesso. Quando l'inibitore si lega causa un cambiamento della forma tridimensionale dell'enzima che ha come conseguenza una modificazione del sito attivo e la conseguente impossibilità per il substrato di legarsi ad esso. mutuamente escludenti

Un inibitore competitivo ridurrà l'affinità enzima substrato, cioè aumenterà il valore di Km. Ad alte concentrazioni di substrato la reazione non viene rallentata e Vmax è sempre la stessa.

Il substrato non viene più convertito in prodotto Inibizione non competitiva Il substrato non viene più convertito in prodotto Un inibitore noncompetitivo si lega al suo sito sull'enzima, lontano dal sito attivo, causando un cambio nella conformazione del sito attivo stesso. In ciò è molto simile agli inibitori competitivi. La differenza sta nel fatto che il substrato si lega comunque al sito attivo ma esso non viene più convertito in prodotto come esemplificato dall'animazione.                                                                                                     Un classico inibitore non competitivo non ha influenza sulla capacità di legarsi del substrato all'enzima anche se il sito attivo è stato modificato nella sua forma, ma l'affinità sarà comunque ridotta. Questi inibitori misti noncompetititvi sembrano avere alcune prorpietà dei competitivi e dei non competititivi. Di fatto inibitori classici non competitivi sono rari, se esistono del tutto. Questi possono essere distinti dai competitivi per il loro effetto sui parametri cinetici..

I                                                                                                                                                 La KM rimane invariata La Vmax diminuisce