Homologous recombination (HR) Homologous recombination (HR) is a multistep process that is mediated by the sequential accumulation of proteins. After detection of the DNA double-strand break (DSB) and resection of the DNA in the 5'3' direction, RAD51 binds to single-stranded (ss)DNA and displaces replication protein A (RPA), which leads to RAD51 polymerization (this phase is referred to as the presynaptic phase). Once the homology search is successful, the duplex is captured and the RAD51 filament invades it to form the heteroduplex structure (synaptic phase). RAD54, a DNA-dependent ATPase, stabilizes the RAD51–ssDNA complex, thereby promoting this process. Heteroduplex DNA extension and branch migration normally occurs during the postsynaptic phase of HR.

DNA polymerases use the intact copy to re-synthesize the deleted DNA sequences, DNA ligases join the newly synthesized fragments and the junctions are resolved by specific endonucleases that are known as resolvases.

Intrinsico Modificazioni spontanee di basi, errori di replicazione Agenti chimici Endogeni Esogeni (radicali (mutageni liberi) chimici) Radiazioni Ultravioletti Ionizzanti Tipo di danno Lesioni al DNA Appaiamenti errati, inserzioni, delezioni, rotture del DNA Modificazioni di basi, siti abasici, rotture del DNA Addotti di DNA, crosslink, rotture del DNA Dimeri di pirimidina, modificazioni di basi Siti abasici, modificazioni di basi, rotture del DNa Quantità e tipo di danno tollerabile Danno eccessivo e/o irriparabile Estensione del danno e severità Risposta cellulare Attivazione del network della risposta Attivazione della pathway apoptotica Conseguenze Sopravvivenza cellulare Trasformazione maligna Morte cellulare

 Overview sul controllo del ciclo cellulare Due punti irreversibili nel ciclo cellulare Replicazione del materiale genetico Separazione dei cromatidi fratelli Checkpoints centromere sister chromatids 

La lunghezza del ciclo cellulare e la durata di ciascuna fase sono controllate da segnali chimici esterni ed interni. La transizione da ciascuna fase del ciclo richiede l’integrazione di segnali chimici specifici e risposte precise a questi segnali. Un checkpoint è costituito da un insieme di eventi che bloccano l’avanzamento della cellula nel ciclo fino a quando un processo cellulare importante sia completato.

Tre principali checkpoints: G1/S can DNA synthesis begin? G2/M has DNA synthesis been completed correctly? commitment to mitosis spindle checkpoint are all chromosomes attached to spindle? can sister chromatids separate correctly?

G1/S checkpoint Uno dei più importanti punti di controllo del ciclo cellulare, detto START, si trova alla metà della fase G1 In questo punto la cellula riceve segnali interni ed esterni per stabilire quando è opportuno avanzare nella fase S: Segnali interni: dimensione della cellula e nutrizione della cellula. Segnali esterni : “fattori di crescita” Se la cellula non riceve segnali, esce dal ciclo ed entra nella fase G0

G0 phase G0 phase non-dividing, differentiated state most human cells in G0 phase liver cells in G0, but can be “called back” to cell cycle by external cues nerve & muscle cells highly specialized arrested in G0 & can never divide

CDK e cicline activated Cdk Due tipi di proteine hanno un ruolo importante nella progressione del ciclo cellulare: le cicline e le chinasi ciclina-dipendenti (CDK). I complessi formati tra le cicline e le CDK inducono la progressione del ciclo cellulare. Le CDK regolano le attività di altre proteine trasferendo loro gruppi fosfato. Quando le cicline sono assenti , le CDK sono inattive. activated Cdk

Spindle checkpoint G2 / M checkpoint M cytokinesis C G2 mitosis G1 S Chromosomes attached at metaphase plate Replication completed DNA integrity Inactive Active Active Inactive Cdk / G2 cyclin (MPF) M APC cytokinesis C G2 mitosis G1 S Cdk / G1 cyclin Inactive MPF = Mitosis Promoting Factor APC = Anaphase Promoting Complex Active G1 / S checkpoint Growth factors Nutritional state of cell Size of cell

Lo START è regolato dalle cicline di tipo D unite alla CDK4. Proteine inibitorie con la capacità di percepire problemi nella fase G1 tardiva, come danni al DNA, possono frenare il complesso ciclina -CDK e impedire che la cellula entri nella fase S.

Cyclin & Cyclin-dependent kinases CDKs & cyclin drive cell from one phase to next in cell cycle proper regulation of cell cycle is so key to life that the genes for these regulatory proteins have been highly conserved through evolution the genes are basically the same in yeast, insects, plants & animals (including humans)

Growth factor signals growth factor cell division cell surface nuclear pore nuclear membrane P P cell division cell surface receptor Cdk protein kinase cascade P E2F P chromosome Rb P E2F cytoplasm Rb nucleus

p53 — master regulator gene NORMAL p53 p53 allows cells with repaired DNA to divide. p53 protein DNA repair enzyme p53 protein Step 1 Step 2 Step 3 DNA damage is caused by heat, radiation, or chemicals. Cell division stops, and p53 triggers enzymes to repair damaged region. p53 triggers the destruction of cells damaged beyond repair. ABNORMAL p53 abnormal p53 protein cancer cell Step 1 Step 2 DNA damage is caused by heat, radiation, or chemicals. The p53 protein fails to stop cell division and repair DNA. Cell divides without repair to damaged DNA. Step 3 Damaged cells continue to divide. If other damage accumulates, the cell can turn cancerous.

Trends in Cell Biology 2002;12:509-16

Human DNA damage response pathway Replication block Sensors Effectors Signals Transducers Common intermediate ATM Rad17/RFC or ATR Hus1/Rad1/Rad9 Chk1 BRCA1 Others p53 Cell cycle arrest Apoptosis DNA repair

Meccanismo della ricombinazione (Modello di Holliday, rottura ad elica singola)

Meccanismo della ricombinazione (Modello di Holliday,rottura ad elica singola) Eteroduplex: appaiamento temporaneo di eliche non complementari

Meccanismo della ricombinazione (Modello di Holliday,rottura ad elica singola)

L’intervento dell’endonucleasi può portare o non portare al crossing-over

Holliday-junction al microscopio elettronico

Meccanismo della ricombinazione (Modello di Holliday, risoluzioni alternative dell’eteroduplex)

Meccanismo della ricombinazione (Modello di Holliday, conseguenze delle risoluzioni alternative)

Macchie gemelle in Drosophila (Stern) In femmine y+ sn / y sn+

Macchie gemelle Frequenza troppo alta per essere dovute a doppia mutazione

Macchie gemelle

Crossing-over mitotico