Modulo di Biocristallografia Obiettivi formativi: Apprendere le principali tecniche di cristallizzazione di proteine. Acquisire le nozioni di base per comprendere il fenomeno della diffrazione di raggi-X ad opera dei cristalli di proteine. Acquisire le tecniche di raccolta dati utilizzate nella biocristallografia. Apprendere le tecniche per la determinazione della struttura delle proteine: quali metodo della sostituzione isomorfa, metodo della sostituzione molecolare ed uso della dispersione anomala. Apprendere le tecniche per l'affinamento del modello strutturale. Corso Teorico-Pratico di 4 CFU

Processi nella cristallografia di Proteine Over-espressione Purificazione Raccolta dati di diffrazione Interpretazione delle mappe Cristallizzazione H2O reservoir proteina + reservoir 10 giorni 10 anni Calcolo delle mappe di densità elettronica

Organizzazione del corso CRISTALLI DIFFRAZIONE STRUTTURA CRISTALLINA RAGGI-X PROGRAMMA DEL CORSO I Cristalli: Cosa sono i cristalli. Simmetrie nei cristalli. Tecniche di cristallizzazione di proteine. I raggi X: Caratteristiche dei raggi X. Le sorgenti convenzionali e la luce di sincrotrone. La Diffrazione: Interazione raggi-X cristallo. La legge di Bragg. Il fattore di struttura. Tecniche di raccolta della diffrazione La determinazione strutturale: Il problema della fase. Metodo della sostituzione isomorfa. Metodo della sostituzione molecolare. Le mappe di densità elettronica. L'affinamento del modello strutturale. Esercitazioni di laboratorio: Cristallizzazione della lisozima. Raccolta dati di diffrazione della lisozima mediante anodo rotante e tecniche criogeniche. Riduzione dei dati di diffrazione. Risoluzione del problema della fase mediante metodo della sostituzione molecolare. Ricostruzione della struttura proteica nelle mappe di densità elettronica. Affinamento e validazione del modello strutturale.

STATO SOLIDO POSIZIONI VINCOLATE DI ATOMI O MOLECOLE NELLO SPAZIO ORDINATE SOLIDO CRISTALLINO (a lungo raggio) NON ORDINATE SOLIDO AMORFO (a lungo raggio)

Nei cristalli la posizione di un gruppo di atomi viene replicata in modo periodico nelle tre direzioni dello spazio. Ordine a lungo raggio

Nei solidi amorfi è presente al massimo un ordine locale nella disposizione degli atomi. Solido cristallino A2O3 Solido amorfo A2O3 Ordine a corto raggio

FORZE DI COESIONE NEI SOLIDI LEGAMI CHIMICI TIPI DI CRISTALLI COVALENTI CRISTALLI COVALENTI [ Diamante ] IONICI CRISTALLI IONICI [ NaCl ] METALLICI METALLI [ Au] AD IDROGENO CRISTALLI MOLECOLARI FORZE DI VAN DER WAALS [zucchero]

Morfologia dei cristalli (habit) Facce piane e spigoli vivi

legge della costanza dell'angolo diedro ottenuta su base sperimentale nel 1783 da Rome de l'Isle (1736-1790) . Gli angoli diedri tra facce equivalenti di cristalli della stessa forma cristallina sono costanti a a

Dove h,k,l sono numeri interi primi tra loro e generalmente piccoli La legge di Haüy (o legge di razionalità degli indici o seconda legge della cristallografia) è una legge fondamentale della cristallografia che regola la giacitura reciproca delle facce dei cristalli. Se si assumono come terna di assi di riferimento di un cristallo tre rette parallele a tre spigoli convergenti (non complanari) (a b c), i rapporti delle intercette (a’ b’ c’) ottenute da due facce qualsiasi del cristallo stanno tra loro come tre numeri razionali, (rapporto di numeri interi): a”/a’=h/m b”/b’=k/n c”/c’=l/o Questo implica che esiste una terna di assi a, b, c tale che: a/a’=h b/b’=k c/c’=l. Dove h,k,l sono numeri interi primi tra loro e generalmente piccoli

INDICIZZAZIONE DELLE FACCE Scegliendo questo opportuno sistema di riferimento tutte le facce di un cristallo possono quindi essere indicizzate con delle terne di numeri interi chiamati indici di Miller che rappresentano il reciproco delle intercette rispetto ai tre assi del sistema di riferimento

Forme cristalline Cristalli di una data forma cristallina possono avere una diversa morfologia che dipende dal processo di crescita ma hanno comunque lo stesso sistema di riferimento che indicizza le facce ISOMORFISMO: Cristalli ottenuti da sostanze diverse che hanno un sistema di riferimento molto simile per indicizzare le facce POLIMORFIMO: Cristalli ottenuti dalla stessa sostanza che hanno sistemi di riferimento diversi per indicizzare le facce

Modello di cristallo di Hauy Microscopia elettronica 1801 Traité de Minéralogie La morfologia del cristallo deriva dalla ripetizione regolare di un parallelepipedo chiamato cella elementare

Struttura cristallina b c g Cella elementare

L’unità ripetitiva Cella elementare Parametri di cella a, b, c, a, b, g Reticolo cristallino Nodi reticolari

Legge di Bravais Le facce dei cristalli sono parallele a piani reticolari con alta densità di nodi

I piani reticolari vengono individuati da una terna di numeri interi Indici di Miller Il piano con indici di Miller hkl intercetta gli assi nei punti: a/h b/k c/l

Un piano cristallografico passa almeno per tre nodi reticolari Piani reticolari Un piano cristallografico passa almeno per tre nodi reticolari Per ogni nodo passa un piano di una data famiglia di piani cristallografici Le proprietà del reticolo implicano che in una famiglia di piani, i piani sono tra loro equispaziati da una grandezza costante indicata solitamente con la lettera d. Fissata una certa origine esisterà un piano della famiglia di piani con indici di Miller (hkl) a una distanza dhkl dall'origine che intersecherà gli assi della cella cristallografica nelle coordinate a/h, b/k e c/l.

Famiglie di piani Nel caso particolare di una famiglia di piani parallela ad un asse, questo piano cristallografico avrà 0 come indice di Miller in quanto l'intercetta rispetto a questo asse è . I piani relazionati alle facce di un cristallo sono piani reticolari in senso stretto (cioè i piani che passano per i nodi reticolari) ed hanno come indici di Miller dei numeri interi più piccoli possibili tra loro E’ tuttavia comodo estendere gli indici di Miller a tutte le terne di numeri interi positivi e negativi (indicati con una barra). In questo modo si comprendono anche le famiglie di piani che non sono piani reticolari in senso stretto ma sono piani paralleli a piani reticolari con spaziature che sono sottomultipli interi di piani reticolari veri e propri. NB due famiglie di piani con indici di Miller che differiscono solo dal segno sono la stessa famiglia di piani con la stessa spaziatura vista in direzione opposta

Facce e direzioni nei cristalli Dal punto di vista formale una famiglia di piani viene solitamente indicata con gli indici hkl senza nessuna parentesi, mentre per indicare una faccia cristallina o la direzione in un cristallo, i tre indici hkl sono chiusi rispettivamente in parentesi tonde (hkl) e in parentesi quadre [hkl]. [010] [001] [100] (010) (001)

Simmetria nei cristalli CRISTALLO Fase condensata in cui la materia è disposta con simmetria periodica per traslazione Sono presenti anche operatori di simmetria che relazionano tra loro le molecole Significa che le entità chimiche contenute nel cristallo sono correlate tra di loro da elementi di simmetria che si ripetono costantemente e periodicamente nello spazio in tre dimensioni

OPERAZIONE DI SIMMETRIA ELEMENTO DI SIMMETRIA Entità geometrica rispetto alla quale si esegue l’operazione di simmetria OPERAZIONE DI SIMMETRIA Movimento che trasforma un oggetto in un oggetto identico o equivalente a quello iniziale (oggetto congruente) Elemento Operazione PUNTO INVERSIONE ASSE ROTAZIONE PIANO RIFLESSIONE

Simmetrie nei cristalli La simmetria esterna dei cristalli è strettamente relazionata alla disposizione simmetrica interna delle molecole

Congruenza Traslazione Inversione Rotazione Roto-inversione Diretta Inversa Traslazione Rotazione Roto-traslazione Inversione Roto-inversione Roto-inversione-traslazione incompatibili con molecole chirali enantiopure compatibili con miscele racemiche e molecole achirali compatibili con tutte le molecole anche molecole chirali enantiopure

Assi di rotazione compatibili con il reticolo cristallino Asse di ordine 1 rotazione di 360° (identità) Asse di ordine 2 (180°) Asse di ordine 3 (120°) Asse di ordine 4 (90°) Asse di ordine 6 (60°)

Assi di rotazione non compatibili con il reticolo cristallino Assi di ordine 5 di ordine 7 e superiori

Assi di roto-traslazione compatibili con il reticolo cristallino Asse screw 21 Asse 2 180° 180° 180° 180° 180° 180° Asse 3 Assi screw 31 32 Asse 4 Assi screw 41 42 43 Asse 6 Assi screw 61 62 63 64 65

Roto-inversioni compatibili con il reticolo cristallino Centro di inversione 1 Piano di simmetria 2 = m Rotoinversione 4 Rotoinversione 3 Rotoinversione 6

Riflessione e traslazione di mezza cella Roto-inversioni con traslazione compatibili con il reticolo cristallino Piani glide a, b, c n, d Riflessione e traslazione di mezza cella

Vincoli imposti ai parametri di cella dagli elementi di simmetria Asse 2 b Asse 3 e 6 Asse 4 a a=90° b=90° a a=90° b=90° a=b g=120° a=b g=90° b b

6 famiglie cristalline e 7 sistemi cristallini Simmetria minima FAMIGLIA - SISTEMA vincoli sulla cella nessuna Triclino nessuno asse di ordine 2 Monoclino a=g=90° 3 assi di ordine 2 perpendicolari Ortorombico a=b=g=90° asse di ordine 4 Tetragonale a=b a=b=g=90° asse di ordine 3 Esagonale Trigonale a=b g=120° a=b=90° asse di ordine 6 Esagonale a=b g=120° a=b=90° 4 assi di ordine 3 lungo le diagonali Cubico a=b=c a=b=g=90°

Simmetria e reticoli centrati b a c a=90° g Asse 2 P C

14 reticoli di Bravais mC mP aP oI oC oF oP hP hR tI tP cP cI cF

32 classi cristalline (gruppi puntuali cristallografici) Vengono generate da tutte le possibili combinazione dei semplici elementi di simmetria puntuale (senza traslazione) compatibili con il reticolo 11 Classi di simmetria Laue (gruppi puntuali centrosimmetrici) Triclino 1, 1 Monoclino 2, m, 2/m Ortorombico 222, mm2, mmm Tetragonale 4, 4, 4/m, 422, 4mm, 42m, 4/mmm Trigonale 3, 3, 32, 3m, 3m Esagonale 6, 6, 6/m, 622, 6mm, 62m, 6/mmm Cubico 23, m3, 432, 43m, m3m

11 coppie enantiomorfe (esempio P31 e P32) 230 gruppi spaziali Generati dalla combinazione di tutti gli elementi di simmetria compatibili con il reticolo, comprese le operazioni con traslazione (screw e glide) con i 14 reticoli di Bravais 65 gruppi spaziali compatibili con le molecole biologiche enantiomorfe in quanto non contengono elementi di rotoinversione 11 coppie enantiomorfe (esempio P31 e P32)

Tavole internazionali per la cristallografia Gruppo puntuale Simbolo gruppo spaziale Herman-Mauguin (corto & lungo) Sistema cristallino Coordinate frazionarie Schoenflies Simmetria Laue asse parallelo o piano perpendicolare a b Posizioni generali equivalenti Proiezioni ortogonali Siti Wyckoff Subgruppi e supergruppi