Fotoassimilazione della CO2   La nutrizione di un organismo autotrofo si basa sulla funzione dei cloroplasti La produzione di ATP e NADPH sono il presupposto per tutte le altre attività del cloroplasto, che consistono nel produrre intermedi C3 e idrati di carbonio, nel ridurre composti dell'azoto ad ammine e dello zolfo a gruppi -SH Il cloroplasto ha inoltre la proprietà di sintetizzare autonomamente un grande numero di sostanze come i lipidi e gli amminoacidi In questo senso il cloroplasto assomiglia ad un organismo procariotico fotosintetico come la Chlorella, un'alga unicellulare

La sintesi degli zuccheri può svolgersi in tre direzioni: Per fotoassimilazione si intende una complessa sequenza di reazioni attraverso le quali la CO2 viene trasformata in zuccheri Dapprima si passa attraverso un pool di molecole C3 dalle quali si formano zuccheri di riserva e sostanze strutturali per nuove cellule La sintesi degli zuccheri può svolgersi in tre direzioni: 1) sintesi di amido come riserva intermedia nel cloroplasto 2) trasporto degli intermedi nel citoplasma con lo scopo di fornire i composti per la sintesi delle membrane 3) esporto degli intermedi nel citoplasma per la produzione di sostanze di trasporto per trasportarle verso altre cellule

Per la fissazione della CO2 nel cloroplasto si susseguono tre fasi: carbossilazione, riduzione e rigenerazione del substrato Il processo di FOTOASSIMILAZIONE della CO2 è detto Ciclo di Calvin dal nome di Melvin Calvin che nel 1961 vinse a questo proposito il premio Nobel ed avviene nello stroma dei cloroplasti Il ciclo è caratterizzato da tre fasi distinte: - FASE DI CARBOSSILAZIONE FASE DI RIDUZIONE FASE DI RIGENERAZIONE

FASE DELLA CARBOSSILAZIONE   Il primo step consiste nell’addizione di una molecola di CO2 ad un composto a cinque atomi di carbonio (RIBULOSIO-1,5-BISFOSFATO, RuBP) Questa reazione chiave è catalizzata dall’enzima Rubisco (Ribulosio-1,5-bisfosfato carbossilasi/ossigenasi), uno degli enzimi più diffusi sulla terra L'enzima RUBISCO coordina i substrati RuBP e CO2 e favorisce la formazione di un composto intermedio ipotetico che non si libera, ma si scinde in 2 molecole di un composto C3, l’ACIDO 3-FOSFO GLICERICO (PGA)

La RUBISCO è uno degli enzimi più importanti sulla Terra e sicuramente uno dei più diffusi. E’ inoltre l’unico enzima che è capace di fissare la Co2 atmosferica per la formazione di biomassa RAPPRESENTA IL PREREQUISITO ESSENZIALE PER L’ESISTANZA DELLA VITA SULLA TERRA Costituisce il 15% delle proteine totali del cloroplasto ed è stato stimato che nel mondo se ne trovino circa 40 milioni di tonnellate Dal nome si comprende come questo enzima svolga anche un’azione ossigenasica della quale tratteremo in seguito Adesso concentreremo la nostra attenzione sulla funzione carbossilasica che svolge nell’ambito del ciclo di Calvin

L’enzima Rubisco è un eteropolimero (circa 560 kDa) formato da otto subunità identiche (51-58 kDa) (unità LSU) codificate da un gene del cloroplasto e da otto subunità identiche più piccole  (12-18 kDa) (unità SSU) codificate da un gene nucleare Su ogni subunità maggiore esiste un sito attivo che lega i substrati CO2 e RuBP e l’attivatore Mg2+, mentre l’azione delle unità SSu non è ancora chiara in quanto non sembra essenziale per la fissazione della CO2

Rubisco Il processo di carbossilazione è veramente lento; infatti, al livello di saturazione solo 3 moli di CO2 ed una di RuBP sono convertite per secondo al livello del sito catalitico della Rubisco A causa di questo lento ritmo di catalisi una grande quantità di molecole di Rubisco sono necessarie per garantire il flusso della fotosintesi Si stima che la Rubisco può rappresentare anche il 50% delle proteine totali solubili fogliari

Attivazione della Rubisco La Rubisco è attiva solo quando un gruppo amminico della lisina (posizione 201) reagisce con la CO2 per formare CARBAMMATO a cui è legato il magnesio: E-lys-NH3+ + CO2 ↔ E-lys-NH-COO- + 2H+ + Mg2+↔ E-lys-NH-COO-Mg2+ L’attivazione è determinata da cambiamenti conformazionali della LSU ed è stabilizzata dallo ione magnesio L’attivazione della Rubisco richiede ATP ed è catalizzata dall’enzima Rubisco attivasi

L’attività della Rubisco è dipendente dalla luce Optimum di pH (circa 8) È raggiunto nello stroma del cloroplasto a seguito del trasporto elettronico durante il quale si ha un trasporto netto di H+ dallo stroma al lumen dei tilacoidi Necessità della presenza di Mg2+ La concentrazione aumenta a seguito del trasporto elettronico cloroplastico come controione degli H+

L’attivazione della Rubisco alla luce è mediata da una proteina la Rubisco attivasi (RCA), la cui attività è a sua volta massima in presenza di ATP e di RuBP e la sua funzione è quella di catalizzare la carbammilazione della Rubisco da parte della molecola attivatrice della CO2

Un potente inibitore della Rubisco, il 2-carbossiarabinitolo-1-fosfato (CA1P), raggiunge alte concentrazioni solo di notte mentre è degradato alla luce da una fosfatasi che stacca il fosfato dal carbonio 1

L'equilibrio   HCO3- + H +  H 2O + CO 2 è regolato, al livello delle membrane dei tilacoidi, dall’enzima CARBONICO ANIDRASI Gli ioni Mg++ sono essenziali per la carbossilazione oltre al pH: valori elevati di pH favoriscono l’affinità per il Mg 2+ e la formazione di un complesso carbammato-Mg 2+ che è il presupposto per l’aggancio del ribulosio difosfato Al buio la concentrazione di Mg2+ ed il pH sono subottimali per la Rubisco Alla luce si ha contemporaneamente un trasporto di H + dentro i tilacoidi ed un trasporto di Mg 2+ nello stroma

FASE DELLA CARBOSSILAZIONE

FASE DELLA RIDUZIONE Il ciclo di Calvin o via riduttiva del pentosofosfato può svolgersi solo alla luce in quanto dipende dalla disponibilità di ATP e NADPH a forti dosi. La riduzione del PGA avviene in due fasi catalizzate da una chinasi (fosforilazione) (ENZIMA 1) e da una deidrogenasi NADPH dipendente (ENZIMA 2) :   1) FOSFOGLICERATO-CHINASI (ATP-dipendente) 2) GLICERALDEIDE-3FOSFATO-DEIDROGENASI (NADPH dipendente) Il senso della reazione è determinato dalle concentrazioni di ATP e NADPH (provenienti dal trasporto elettronico)

FASE DELLA RIGENERAZIONE Una parte dei triosifosfati sono esportati dal cloroplasto per la sintesi di molecole più complesse In un processo noto come la fase di rigenerazione, una parte dei triosi-fosfati vengono utilizzati per la sintesi del ribulosio-1,5-bisfosfato necessario per la reazione iniziale del Calvin Questo processo richiede energia che viene fornita dall’ATP. Tredici sono gli enzimi coinvolti nell’intero ciclo di Calvin e la sua efficienza di conversione dell’energia è di circa il 90%. Le reazioni non coinvolgono la trasduzione dell’energia ma piuttosto riarrangiamenti dell’energia chimica

Rigenerazione dei pentosi   1) Triosofosfato isomerasi 2) Aldolasi 3) Fruttosio-1,6-bisfosfato fosfatasi 4) Transchetolasi 5) Sedoeptulosio-1,7-bisfosfato fosfatasi

Attivazione degli enzimi della fase oscura da parte della luce Oltre la Rubisco anche altri enzimi del ciclo di Calvin sono regolati dalla luce: -3-FOSFO GLICERALDEIDE DEIDROGENASI -FRUTTOSIO-1,6-BISFOSFATO FOSFATASI -SEDOEPTULOSIO-1,7-BISFOSFATO FOSFATASI -RIBULOSIO-1,5-BISFOSFATO CHINASI I meccanismi di attivazione di questi enzimi sono indiretti in quanto l’energia luminosa non è direttamente assorbita dagli enzimi che sono incolori E’ coinvolta l’energia luminosa assorbita dal PSII e dal PSI del trasporto elettronico

Questi enzimi contengono nella loro molecola ponti disolfuro (S-S) che alla luce sono ridotti a due gruppi sulfidrici (SH) La riduzione del ponte disolfuro determina una importante modificazione nella struttura proteica per cui la sua attività aumenta Nella riduzione sono utilizzati gli elettroni che provengono dalla fotolisi dell’acqua nel PSII e che non vengono utilizzati per la riduzione del NADP+ In particolare il processo vede coinvolte le tioredoxine attraverso l’azione dell’enzima FERREDOSSINA-TIOREDOXINA RIDUTTASI Nei cloroplasti intensamente illuminati nei quali le riserve del NADP+ sono ridotte, si accumula Fd(Fe2+) che determina l’attivazione degli enzimi del ciclo di Calvin

Bilancio energetico della fotosintesi L’ATP ed il NADPH necessari per il ciclo di Calvin vengono rilasciati nello stroma durante la fase luminosa del processo Occorrono 2 fotoni perché un elettrone passi attraverso il PSII ed il PSI; 2 sono gli elettroni richiesti però per ridurre una molecola di NADP+ quindi saranno necessari 4 fotoni per ridurre una molecola di NADPH Ciò corrisponde anche ad 8 fotoni per molecola di O2 evoluta Ridurre una mole di CO2 a zucchero (CH2O)n richiede 2 moli di NADPH e 3 di ATP. Se consideriamo una molecola di glucosio prodotta, 6 molecole di CO2 devono essere fissate ed assimilate e questo richiederà 12 molecole di ATP e 12 di NADPH

12 NADP+ + 18 ADP + 18 Pi + 6H+ 48 fotoni  6O2 + 12 NADPH + 18 ATP + 6H2O 6H2O + 6CO2 + 48 fotoni  C6H12O6+ 6O2

Fotorespirazione La Rubisco come abbiamo visto può comportarsi come un’ossigenasi anziché come una carbossilasi Le cellule vegetali contengono i mitocondri e quindi respirano per produrre ATP. In questo processo viene consumato ossigeno e prodotta CO2. Il processo, noto con il nome di respirazione, avviene nelle piante indipendentemente dalla luce Tuttavia, in molte specie vegetali un altro tipo di respirazione avviene solo in presenza di luce ed è noto con il nome di FOTORESPIRAZIONE. Questo processo comporta la cooperazione di cloroplasti, perossisomi e mitocondri La reazione di ossigenasi operata dalla Rubisco determina la formazione dell’acido 3-fosfoglicerico e di un prodotto a due atomi di carbonio, l’acido fosfoglicolico

Il perché della fotorespirazione La fotorespirazione potrebbe essere considerato un processo inutile Infatti: il ribulosio-5-P viene sottratto dal ciclo di Calvin viene consumato O2 e liberata CO2 solo una parte degli atomi di C ritorna al cloroplasto si consuma ATP

Alcuni Autori hanno ipotizzato che la fotorespirazione che diminuisce l’efficienza della fotosintesi, costituisca un mezzo per eliminare NADPH ed ATP prodotti in eccesso quando i livelli di irradianza sono eccessivamente elevati L’eliminazione di potere riducente potrebbe preservare dal danneggiamento i pigmenti presenti nel cloroplasto

Fissazione della CO2 nella piante C4 (via degli acidi bicarbossilici) In alcune specie la reazione primaria di carbossilazione è diversa da quella a cui partecipa il ribulosio 1,5-difosfato ed il primo prodotto della reazione non è il 3PGA, bensì una acido a 4 atomi di carbonio Le specie che hanno questo tipo di metabolismo vengono comunemente dette specie C4, mentre quelle che fissano inizialmente la CO2 nel 3PGA sono dette specie C3 La maggior parte delle specie C4 sono monocotiledoni, in particolare graminacee, anche se appartengono al gruppo più 300 dicotiledoni

Tra le piante coltivate si annoverano fra le C4 il mais, il sorgo e la canna da zucchero Tutte le piante arboree ed arbustive sono piante C3 Nelle specie C4 esiste anche una divisione di compiti tra due diversi tipi di cellule fotosintetiche: le cellule del mesofillo e quelle della guaina del fascio (ANATOMIA KRANZ) Il processo delle piante C4 è considerato più evoluto del sistema C3 ed è fortemente connesso alle condizioni ambientali Le alte temperature favoriscono l’attività ossigenasica rispetto a quella carbossilativa della Rubisco e questa ha come conseguenza una minore efficienza fotosintetica. Questo sembra dovuto in parte a cambiamenti nella solubilità di O2 e della CO2

La via comprende la fissazione dello ione HCO3- nelle cellule esterne del mesofillo, la fissazione di questo in un acido a 4 atomi di carbonio, il trasferimento di questo nelle cellule della guaina del fascio ed quindi il rilascio della CO2 che viene ri-fissata mediante il ciclo di Calvin-Benson Nelle piante C4 infatti gli enzimi del ciclo di Calvin sono localizzati esclusivamente nelle cellule della guaina del fascio, mentre l’acido organico (ossalacetato) prodotto dalla fissazione dello ione HCO3- è presente sono nel citosol delle cellule del mesofillo

L’enzima chiave per la fissazione è rappresentato dalla fosfoenolpiruvato carbossilasi (PEP carbossilasi), la quale utilizza lo ione HCO3- e non la CO2 Questo determina una maggiore efficienza in quanto in soluzione acquosa è favorita la formazione dello ione HCO3- rispetto alla CO2 gassosa La PEP carbossilasi inoltre non può fissare l’ossigeno che ha un struttura tridimensionale simile alla CO2 ma non all’HCO3- La reazione iniziale catalizzata dalla PEPcase è la combinazione con il substrato di partenza, il fosfoenolpiruvato (PEP) con lo ione carbonato per formare ossalacetato. Questa reazione è irreversibile

Sono conosciute tre varianti della fotosintesi nelle piante C4, che differiscono per: - acido C4 trasportato nel cellule della guaina - meccanismo di decarbossilazione che avviene nelle cellule della guaina

FOTOSINTESI C4 TIPO ENZIMA MALICO NADP+-DIPENDENTE FOTOSINTESI C4 TIPO ENZIMA MALICO NAD+-DIPENDENTE FOTOSINTESI C4 TIPO PEP CARBOSSICHINASI

PIRUVATO + ATP + Pi  PEP + AMP + PPi UNA DELLE REAZIONI CHIAVE DEL METABOLISMO DELLE PIANTE C4 E’ LA SINTESI DEL PEP CATALIZZATA DALL’ENZIMA PIRUVATO-ORTOFOSFATO DICHINASI PIRUVATO + ATP + Pi  PEP + AMP + PPi LA REAZIONE RICHIEDE QUINDI LA CONVERSIONE DI 2 MOLI DI ATP PER OGNI MOLECOLA DI CO2 RILASCIATA NELLE CELLULE DELLA GUAINA DEL FASCIO SI HA QUINDI UN CONSUMO SUPERIORE DI ENERGIA RISPETTO AL METABOLISMO C3 OCCORRE TUTTAVIA SOTTOLINEARE L’ASSENZA IN QUESTE PIANTE DEL PROCESSO DI FOTORESPIRAZIONE CHE TIPICAMENTE CONSUMA ATP

E’ INFATTI ACCERTATO CHE I CLOROPLASTI DELLE CELLULE DELLA GUAINA DEL FASCIO NON HANNO MEMBRANE IMPILATE E MOSTRANO UNA BASSISSIMA ATTIVITA’ DEL PSII QUESTO ESCLUDE IL PROCESSO FI FOTOLISI DELL’ACQUA CON LIBERAZIONE DI OSSIGENO FAVORENDO QUINDI L’ATTIVITA’ CARBOSSILATIVA DELLA RUBISCO

ANCHE L’ATTIVITA’ DI ALCUNI ENZIMI DEL CICLO C4 SONO REGOLATI DALLA LUCE ANCHE SE CON SISTEMI DIVERSI: Malato Deidrogenasi NADP-dipendente PEPcase Piruvato- Ortofosfato Dichinasi

MALATO DEIDROGENASI NADP-DIPENDENTE La sua regolazione avviene attraverso il ciclo delle tioredoxine PEPcase Sono entrambe regolate per fosforilazione La PEPcase NON FOSFORILATA presente nelle foglie adattate al buio è inibita dal malato ed ha affinità bassa per il PEP: è quindi una forma essenzialmente inattiva al buio Alla luce vie attivata una CHINASI che fosforila un residuo serinico della PEPcase ed in questa forma l’enzima è meno sensibile alla concentrazione di malato

Meno attivo PEP carbossilasi chinasi Luce Buio Più attivo PEP carbossilasi chinasi ATP ADP OH OP Ser Ser PEPcase PEPcase

PIRUVATO- ORTOFOSFATO DICHINASI (PPDK) La regolazione di questo enzima è piuttosto complessa e coinvolge diverse reazioni che danno un enzima fosforilato inattivo al buio ed un enzima defosforilato alla luce La sorgente del gruppo fosfato è l’ADP la cui concentrazione aumenta al buio quando la concentrazione di ATP è bassa ed aumenta quindi la fosforilazione della PIRUVATO-ORTOFOSFATO DICHINASI La proteina di regolazione è bicatalitica e regola quindi sia la fosforilazione che la defosforilazione NON E’ ANCORA CHIARO IL RUOLO DELLA LUCE

OH OP ADP AMP Thr Thr PROTEINA REGOLATRICE PPDK PPDK Attivo LUCE Inattivo BUIO Pi PPi

Metabolismo acido delle crassulacee (PIANTE CAM) E’ una ulteriore fissazione della CO2 ed è tipica di specie che vivono in climi aridi. Esse sono caratterizzate da habitus xerofitico con rapporti superficie/volume relativamente bassi, una spessa cuticola e conseguente basso ritmo di traspirazione La maggior parte delle cellule fotosintetizzanti delle foglie o del fusto forma un tessuto lacunoso e presenta vacuoli molto grossi. Anche se poco distinguibili sono presenti anche le cellule della guaina del fascio Il metabolismo attraverso il quale queste piante fissano la CO2 è peculiare ed è stato definito come metabolismo acido delle crassulacee (CAM)

Si ha una suddivisione non solo spaziale ma anche temporale del processo di assimilazione e fissazione della CO2 Per questo motivo esse aprono gli stromi durante la notte (la temperatura è più bassa e l’umidità relativa più elevata) e fissano la CO2 nell’acido malico L’acido malico viene “raccolto” negli enormi vacuoli presenti in queste piante. Nel metabolismo CAM è ancora poco chiaro perché queste piante fissino la CO2 attraverso la PEPcarbossilasi, dato che entrambi gli enzimi sono presenti.

Una spiegazione possibile è data dal fatto che la PEP carbossilasi durante il giorno si converte in una forma inattiva, che ha affinità minore per il PEP ed è fortemente inibita dall’acido malico; ma si verificano anche variazioni di altri enzimi che favoriscono la fissazione della CO2 da parte della PEP carbossilasi durante la notte e quella della Rubisco durante il giorno

IL MECCANISMO CHE TIPICAMENTE INIBISCE LA PEPcase NELLE PIANTE C4 AL BUIO NON AGISCE OVVIAMENTE NELLE PIANTE CAM L’ATTIVAZIONE DELLA PEPcase ALLA NOTTE E LA SUA DISATTIVAZIONE FURANTE IL GIORNO AVVIENE ATTRAVERSO UN RITMO CIRCADIANO ENDOGENO LA FORMA DIURNA DELL’ENZIMA E’ INIBITA DAL MALATO, MENTRE LA FORMA NOTTURNA E’ INSENSIBILE AL MALATO

Differenze tra piante C3 e piante C4 I meccanismi di fissazione della CO2 delle C4 e delle CAM sono considerati una evoluzione adattativa del metabolismo C3; nelle prime a condizioni di alta irradianza, elevate temperature e carenza idrica, nelle seconde ad ambienti decisamente desertici

Piante C4: sviluppo di un meccanismo di fissazione più efficiente, con velocità di assimilazione della CO2 mediamente più elevate delle piante C3 una fissazione più efficiente anche a basse concentrazioni di CO2, perché la PEP carbossilasi ha localizzazione citoplasmatica (minori resistenze al flusso di CO2), utilizza come substrato l’HCO3-, non subisce la competizione dell’O2 rispetto alla CO2 ed ha una affinità per il substrato maggiore della Rubisco. Infatti il punto di compensazione per la CO2 (cioè la concentrazione di CO2 esterna per la quale il flusso fotosintetico eguaglia quello respiratorio) è nella C4 più basso (intorno a 10 ppm) rispetto alle C3 (50-60 ppm)

non presentano fotorespirazione apparente sia perché nei cloroplasti delle cellule più interne (guaina del fascio), dove interviene la Rubisco, la competizione dell’O2 è minore, sia perché non è presente il PSII e non si ha quindi splitting dell’acqua e liberazione di O2 la possibilità di fotorespirazione nelle piante C4 non è da escludersi completamente; sono presenti infatti tutti gli enzimi del ciclo fotorespiratorio. Tuttavia l’eventuale CO2 liberata per fotorespirazione può essere rifissata dalla PEP carbossilasi al livello delle cellule del mesofillo più esterne. Da notare che l’assenza del trasporto elettronico non ciclico nei cloroplasti delle cellule più interne rappresenterebbe un problema se gli equivalenti riduttivi in forma di NADPH non venissero ricostituiti nella reazione di decarbossilazione ossidativa dell’acido malico catalizzata dall’enzima malico

In definitiva il sistema di fissazione delle C4 realizza fra le cellule del mesofillo e quelle della guaina una pompa per la concentrazione della CO2 ed uno shuttle per il trasferimento degli equivalenti riduttivi (NADPH) entrambi mediati dall’acido malico