EVOLUZIONE GENETICA ed E. CULTURALE Patrimonio genetico (genoma) ciascun individuo riceve 2 pacchetti discreti (genomi aploidi) da due soli individui della generazione precedente (trasmissione verticale unidirezionale). E’ determinato al momento del concepimento e non viene modificato nel corso della vita. Da un punto di vista quantitativo è uguale in tutti gli individui Patrimonio culturale il patrimonio del singolo individuo è rappresentato da frazioni più o meno grandi che provengono da numerosi individui di varie generazioni (precedenti, successive, contemporanea = trasmissione verticale bidirezionale e trasmissione orizzontale). Può essere ampiamente modificato nel corso della vita. Quantitativamente diverso in soggetti diversi

EVOLUZIONE GENETICA ed E. CULTURALE Differiscono molto soprattutto rispetto a: Velocità – nell’e. genetica l’unità di tempo è la generazione, l’e. culturale può essere estremamente rapida Fitness – il no. di figli genetici è limitato, il no. di figli ‘culturali’ può essere elevatissimo La mutazione è casuale, l’invenzione (l’equivalente della mutazione), invece, cerca di soddisfare un bisogno reale (mutazione ‘lamarckiana’), se l’invenzione funziona il suo successo è assicurato (l’effetto della deriva è meno marcato)

EVOLUZIONE GENETICA ed E. CULTURALE I due tipi di evoluzione non sono indipendenti  molte innovazioni culturali hanno profondamente influenzato l’e. biologica e a molti fattori naturali (sia biologici che non) l’uomo si è adattato attraverso innovazioni culturali  l’e. culturale ha permesso alla specie H.sapiens di colonizzare tutti i continenti e ne ha fortemente influenzato l’e. genetica Nel sistema uomo-malaria l’evoluzione culturale ha giocato (e continua a giocare) un ruolo molto importante

EVOLUZIONE GENETICA ed E. CULTURALE L’e. culturale e l’e. genetica non sono indipendenti COEVOLUZIONE BIOLOGICO-CULTURALE Agricoltura e allevamento: invenzioni che hanno avuto un forte impatto sull’evoluzione del genoma Tre focolai di inizio: Medio Oriente e sud-est asiatico ca. 11000 anni fa, Messico 2-3000 anni più tardi

Principali cambiamenti provocati dal passaggio a un’economia agro-pastorale rilevanti per l’evoluzione genetica dell’uomo Passaggio a una vita sedentaria  formazione di gruppi numerosi Grande disponibilità di cibo  espansione demografica Cambiamenti alimentari (introduzione di nuovi alimenti) Nascita di comunità ad elevata densità abitativa  epidemie Modificazione antropica dell’ambiente Arrivo di nuovi patogeni (dovuti anche allo stretto contatto tra uomo e animali)

Alcuni adattamenti nel sistema uomo-plasmodio-zanzara

Adattamento o risposta adattativa insieme di cambiamenti messi in atto da un soggetto nei confronti di un fattore ambientale avverso e che sfocia in una migliore risposta del soggetto a quel fattore ambientale Adattamenti culturali Adattamenti biologici

Adattamenti biologici post-genetici: cambiamenti a breve (brevissimo) termine, il soggetto che si adatta è l’individuo (es. brividi quando si ha freddo; modificazione del no. di gl.rossi a elevate altitudini) genetici: cambiamenti del pool genico di una popolazione, cambiamenti a lungo termine (l’unità di tempo è la generazione), il soggetto che si adatta è la popolazione

Natura del fattore ambientale avverso NON biologico (es. la temperatura o più in generale il clima, l’altitudine ecc.) BIOLOGICO (es. agente patogeno), in questo caso il fattore avverso è capace di contro-adattamenti  partita a scacchi (mosse e contro-mosse)

Adattamenti genetici dell’uomo alla malaria Adattamenti a lungo termine di gruppi di individui a un fattore ambientale biologico (in grado quindi di rispondere con contro-adattamenti)

Distribuzione mondiale della malaria (paludisme) Sachs e Malaney, 2002 WHO-World Malaria Report 2014 > 3 miliardi di persone vivono in zone a rischio (97 paesi) 225 milioni/anno di episodi clinici 660mila decessi/anno 90% in Africa, il 70% sono bambini di età < 5 anni, la mortalità tra i bambini arriva fino al 20% 70% in Africa sub-Sahariana, 25% nel sud-est asiatico

L’agente patogeno della malaria è un protozoo del genere Plasmodium Organismi unicellulari appartenenti al phylum Apicomplexa, sono parassiti dixeni: il loro ciclo biologico si svolge in 2 ospiti obbligati, un vertebrato e un dittero ematofago del genere Anopheles. Il vertebrato è l’ospite intermedio Le specie di plasmodio capaci di infettare l’uomo sono: Plasmodium malariae quartana Pl.ovale terzana benigna Pl.vivax terzana benigna Pl.falciparum terzana maligna

Malaria  sistema complesso che coinvolge 3 soggetti biologici (uomo, zanzara e plasmodio) tutti capaci di evolvere e quindi di rispondere con contro-adattamenti. Uno degli attori (l’uomo) è anche in grado di mettere in atto adattamenti culturali La sopravvivenza del plasmodio dipende strettamente dalla biologia e dall’ecologia dei suoi 2 ospiti e dalle interazioni esistenti tra di essi

CICLO DEL PLASMODIO SVILUPPO NELL’UOMO (fase asessuata) 1. fase epatica, durata di ciascun ciclo 7 gg numero di cicli uno amplificazione 40.000x 2. fase eritrocitaria 1, durata di ciascun ciclo 3-4 gg numero di cicli molti amplificazione per ciclo 20x 3. fase eritrocitaria 2, produzione di micro- e macro-gametociti l’uomo è infettante per la zanzara SVILUPPO NELLA ZANZARA (fase sessuata, durata variabile tra 8 e 30 gg) Nello stomaco: maturazione di micro- e macro-gametocita e fecondazione l’organismo diploide abbandona lo stomaco, va incontro a meiosi seguita da maturazione e proliferazione gli sporozoiti migrano in vari organi, in particolare nella ghiandole salivari. la zanzara è infettante per l’uomo Lopez et al, 2010

Immunità e malaria Il sistema immunitario è relativamente poco efficiente nei confronti della malaria, un’immunità transitoria verso le forme cliniche viene acquisita in seguito ad esposizioni ripetute

Peculiarità del ciclo vitale del plasmodio non comuni a tutte le specie P.vivax e P.ovale producono ipnozoiti (forme dormienti di merozoiti epatici), infettano preferenzialmente i reticolociti P.malariae presenta una forma latente eritrocitaria che può dare recidive anche a distanza di anni, infetta preferenzialmente i gl.rossi vecchi P.falciparum infetta tutti i gl.rossi (parassitemie più elevate), va incontro al fenomeno del ‘rosetting’ e del sequestro (e conseguente variazione antigenica) negli endoteli dei vasi del microcircolo

Significato evolutivo ? Target per vaccini? ‘ROSETTING’  RBC infettati si ‘rivestono’ di RBC non infettati. Non tutti i ceppi di Pl.f. formano ‘rosette’, il fenomeno è meno accentuato in soggetti di gruppo sanguigno 0 Significato evolutivo ? Target per vaccini? Individui ‘immuni’ alla malaria hanno spesso Ab che impediscono il rosetting

Il sequestro e la variazione antigenica Vita media dei gl.rossi ca.120 giorni, vengono distrutti dai macrofagi dei sinusoidi della milza quando la loro membrana mostra segni di invecchiamento I gl.rossi infettati da P.falciparum mostrano segni di ‘invecchiamento precoce’, il loro passaggio nella milza equivarrebbe alla loro eliminazione Il plasmodio sfugge al controllo dei macrofagi della milza evitando di passare in questo organo COME VIENE EVITATO IL PASSAGGIO NELLA MILZA ?

Produzione di ligandi per molecole che rivestono gli endoteli dei capillari  esposizione all’esterno (knobs) di molecole del plasmodio = interruzione della clandestinità immunologica Variazione antigenica: ca. 50 geni var, lo specifico gene var espresso cambia molto spesso, inoltre i geni var presentano elevati tassi di mutazione

Sviluppo del plasmodio all’interno del globulo rosso e formazione degli ‘knobs’ Proteine prodotte dal plasmodio: possono essere riconosciute come ‘non self’ ed attaccate dal sistema immunitario dell’uomo  il plasmodio cambia spesso il tipo di proteine prodotte e in tal modo ‘manda in tilt’ il sistema immunitario dell’uomo

Malaria grave da P.falciparum Malaria cerebrale (a causa del fenomeno del sequestro) Anemia grave (i gl.rossi infettati possono essere molto numerosi, > 50%)

1949 Haldane ‘malaria hypothesis’ la talassemia è una malattia genetica recessiva letale; l’’allele’ thal in alcune popolazioni presenta una frequenza insolitamente elevata (anche dell’ordine di 0.1); nelle restanti popolazioni l’allele thal è praticamente assente; Per un allele letale recessivo si può facilmente dimostrare che q ~ √µ cioè tra √10−6 =10−3 e √10−5 = 3 x10−2 Infatti, all’equilibrio, ad ogni generazione gli alleli persi con gli omozigoti vengono rimpiazzati da alleli di nuova formazione (tramite mutazione) 2q2N = 2 µN Per cui q2 = µ e quindi q = √ µ Questa situazione veniva spiegata ipotizzando che il gene coinvolto presentasse, SOLO in alcune popolazioni, un tasso di mutazione insolitamente elevato, Haldane riteneva che questa fosse un’ASSURDITA’ BIOLOGICA Spiegazione da lui proposta In particolari ambienti l’allele thal è vantaggioso alla stato eterozigote, per cui la sua perdita (attraverso gli omozigoti) viene compensata da una sua trasmissione più efficiente (tramite gli eterozigoti) rispetto a quella dell’allele non-thal

Malaria da Plasmodium falciparum Qual è il fattore ambientale (adattogeno) verso cui gli eterozigoti thal/non-thal sono più resistenti rispetto agli omozigoti normali ? Caratteristiche dell’adattogeno: deve aver agito per molte generazioni; deve essere fortemente avverso (tale da compensare il forte carico genetico); deve avere (o aver avuto) una distribuzione geografica simile a quella della talassemia; deve interagire con i gl.rossi Malaria da Plasmodium falciparum

Poco dopo è stato ipotizzato il valore adattivo (nei confronti della malaria) anche per altri polimorfismi eritrocitari: HbS e enzimopenia G6PD Prove (per lo più indirette) a favore dell’ipotesi di Haldane: Studi casi-controlli: assenza completa (o quasi completa) di eterozigoti AS tra i malati gravi di malaria; Il calo di frequenza dell’allele S tra gli Afro-americani è stato più sensibile rispetto a quello relativo ad altri geni; Correlazione micro-geografica tra frequenza dell’allele thal e malaria (es. Sardegna e Melanesia); Topi transgenici eterozigoti AS sono più resistenti all’infezione da P.berghei

Rapporto costo/beneficio elevato I ‘classici’ adattamenti genetici alla malaria sono buoni o cattivi adattamenti ? Rapporto costo/beneficio elevato Costo elevato  carico genetico segregazionale (ad ogni generazione si ha la perdita di MOLTI individui) Beneficio modesto  è protetta solo una minoranza della popolazione (gli eterozigoti, la cui frequenza è al massimo dell’ordine del 20-30%) e questa protezione forse non è completa ciò nonostante questi adattamenti sono stati adottati da numerose popolazioni

Hot Spot of Recombination (HSR) Gli alleli thal e gli alleli Gd(-) sono esempi di CONVERGENZA EVOLUTIVA FENOTIPICA La presenza dell’allele S in popolazioni diverse e, soprattutto, in aplotipi diversi rappresenta un esempio di CONVERGENZA EVOLUTIVA FENOTIPICA E GENOTIPICA e Gg Ag  d b A B Hot Spot of Recombination (HSR)

Un adattamento ‘perfetto’ a P.vivax: l’omozigosi fyfy Genetica simile a quella del gruppo sanguigno AB0  3 alleli (FY*A, FY*B e FY*BES o fy) A e B codominanti tra loro ed entrambi dominanti su BES (= allele nullo), sono quindi possibili 6 genotipi e 4 fenotipi: A/A e A/BES (a+b-) B/B e B/BES (a-b+) A/B (a+b+) BES/BES (a-b-) L’allele BES ha una mutazione del promotore che ne impedisce l’espressione SOLO a livello di eritroblasti

Un adattamento del plasmodio a un adattamento genetico dell’uomo Studio sulla popolazione del Madagascar (Menard et al., PNAS 2010) Fy(-) Fy(+) TOTALE 476 (72%) 185 (28%) 661 P.v. (+) 42 (8.8%) 44 (23.8%) 86 rapporto Fy(-):Fy(+) nella pop generale 72 : 28 tra i P.v. (+) 49 : 51 Le località con il maggior numero di individui Fy(-);Pv(+) sono quelle con le % più elevate di Fy(+)

è stata dimostrato che individui Fy(-) possono essere infettati da P.v.; la popolazione malgascia è una popolazione mista in cui convivono Fy(+) e Fy(-), i primi potrebbero rappresentare un importante serbatoio di infezione per i Fy(-) i quali sarebbero quindi esposti a infezioni (epatiche) ripetute; in questa situazione il plasmodio avrebbe ampie opportunità di ‘creare’ per mutazione o di attivare un pre-esistente meccanismo di invasione dei gl.rossi Duffy-indipendente

Distribuzione in Africa degli alleli C e S HbC HbS HbC HbC HbC (catena beta, codone 6 glu  lys) – origine monofiletica, frequenza massima in Burkina Faso (12%) HbS (catena beta, codone 6 glu  val) – origine polifiletica, varie regioni africane e asiatiche Entrambe conferiscono resistenza contro la malaria da P.falciparum

Protezione conferita dall’allele C (tratta da Modiano D et al. 2008) L’omozigosi HbC comporta un fenotipo MOLTO meno grave dell’omozigosi HbS Come mai HbC è presente in un’unica regione africana e per di più a frequenze non molto elevate? Nel caso dell’HbS sono protetti gli eterozigoti, l’HbC protegge sostanzialmente gli omozigoti  elevata probabilità per l’allele C di essere eliminato per deriva quando la sua frequenza è ancora bassa (non sono ancora presenti gli omozigoti CC) Protezione conferita dall’allele C (tratta da Modiano D et al. 2008)

Nei portatori di HbS o di HbC si riscontrano densità più elevate di forme sessuate del parassita (gametociti), è stato dimostrato che questi gametociti sono infettanti per la zanzara (Gouagna et al, 2010, Nature Genetics). Questi individui sono più protetti verso le conseguenze cliniche della malattia e trasmettono meglio il parassita

Verra F et al, (2009) Parasite immunology 31, 234-253

Verra F et al, (2009) Parasite immunology 31, 234-253

Possibili spiegazioni Gli studi di associazione casi-controlli di varianti genetiche che si suppone che siano protettive nei confronti della malaria hanno dato risultati contrastanti Possibili spiegazioni La variante protegge solo verso una delle forme di malaria grave La variante protegge dalla malattia causata da uno o pochi ceppi di plasmodio

Studi casi-controlli in cui i casi (malati gravi di malaria) sono stati suddivisi in sottogruppi sulla base del fenotipo clinico (anemia grave, malaria cerebrale, ecc.) Gli eterozigoti AS mostrano un’associazione negativa (= sono protetti) con tutte le forme di malaria grave Gli alfa-thal sono protetti verso l’anemia grave I portatori di HbC sono protetti verso la malaria cerebrale

Polimorfismi malarici classici Ipotesi sui meccanismi di protezione

Distribuzione geografica dell’ ‘allele’ Gd(-)

La glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) Il gene Gd è X-linked, i maschi sono emizigoti

La G6PD è un enzima housekeeping che catalizza la prima reazione della via dei pentoso fosfati (produzione di NADPH)  è essenziale per mantere il giusto livello di glutatione ridotto nelle cellule L’assenza completa di enzima è incompatibile con la vita. Gli effetti negativi dell’enzimopenia (dovuta alla presenza di un enzima instabile) sono riscontrabili solo a livello dei gl.rossi Gl.rossi G6PD(-) vanno incontro ad emolisi quando esposti a forte stress ossidativo

Possibili meccanismi di protezione dell’allele Gd(-)

Ipotesi sul meccanismo di protezione dell’alfa-thal I gl.rossi alfa-thal infettati: sono meno propensi a formare ‘rosetting’; vengono fagocitati più facilmente dai macrofagi; esprimono sulla loro superficie livelli più elevati di Ag del plasmodio i soggetti microcitemici hanno gl.rossi più numerosi e più piccoli rispetto ai soggetti normali  a parità di no. di gl.rossi persi la perdita di Hb è minore inoltre il rilascio in circolo di meno Hb diminuisce il danno ossidativo ai tessuti e il rilascio di citochine pro-infiammatorie

Ipotetico meccanismo protettivo degli alleli C (e S) dell’Hb Fairhurst et al, Nature 2005 Minor espressione, in gl.rossi AC e soprattutto CC infettati in vitro, dei recettori per molecole di rivestimento degli endoteli (i prodotti dei geni var) che sono responsabili del fenomeno del ‘sequestro’ Capacità di gl.rossi infettati di legarsi a endoteli monostrato che esprimono ICAM-1 e CD36 Capacità di formare ‘rosette’ Capacità di essere agglutinati da sieri contenenti Ab ’antiplasmodi’ Idem con varie diluizioni Idem con RBC infettati naturalmente

Ipotetico meccanismo protettivo degli alleli S e C dell’Hb (studi di microscopia elettronica e crio-elettro tomografia) In gl.rossi infettati di soggetti normali il plasmodio utilizza proteine dell’ospite (actina e altre del citoscheletro) per esporre sulla membrana della cellula ospite i ligandi prodotti dai geni var

Sviluppo del plasmodio all’interno del globulo rosso e formazione degli ‘knobs’ Per l’esportazione in membrana delle proteine plasmodiali il parassita utilizza e riorganizza i filamenti di actina della cellula ospite Yellowe, 2009

In RBC infettati compare una struttura membranosa: la Maurer’s cleft

In gl.rossi SS, SC e CC è impedita (o è meno efficiente) la formazione dei filamenti necessari a quest’esportazione in membrana di proteine del plasmodio: i filamenti di actina non sono sufficientemente lunghi per connettere la Maurer’s cleft alla membrana della cellula ospite, la Maurer’s cleft è anormale e gli knob più grandi Cyrklaff et al, 2011

Cryo-electron tomograms (ceppo di plasmodio utilizzato: FCR3CSA) MC = Maurer’s cleft (ciano) K = Knobs (rosso) PM = Membrana plasmatica RBC (blu) V = Vescicole (ciano) Filamenti di actina (giallo) HbAA HbAS RBC infettati RBC non infettati HbAC HbF AS, AC o HbF vs AA Filamenti di actina più lunghi in RBC non infettati (RBC) e più corti in RBC infettati (iRBC) MC atipica Knobs più grandi e meno densi RBC infettati RBC non infettati 100 nm Cyrklaff et al, 2016

I filamenti di actina sono più corti in RBC non infettati AA vs AS, AC o con HbF più lunghi in iRBC rispetto ai non infettati (differenza significativa per AA, AS e HbF) L’aumento di lunghezza causato dall’infezione è nettamente superiore in RBC AA rispetto a RBC AS, AC o con HbF *P < 0,001 nei confronti con RBC AA  P < 0,01 nei confronti tra RBC non infettati e la controparte infettata Confronti vs iRBC AA Confronti vs RBC non infettati AA

La superficie della MC non varia, ma varia il suo volume (minore in RBC AA vs AS, AC e HbF) Knobs più piccoli e più densi in AA vs AS, AC e HbF

Le alterazioni morfologiche di MC e knobs sono accompagnate da alterazioni funzionali In iRBC AS, AC e HbF il gene var2csa viene espresso ma la proteina non raggiunge la superficie dei gl.rossi Efficienza del legame tra iRBC e superfici rivestite di condroitin-solfato (maggiore per iRBC AA vs AS, AC e HbF nonostante livelli comparabili di mRNA per il var2csa)

ESEMPI di ADATTAMENTI del PLASMODIO all’UOMO Alcuni aspetti del suo ciclo vitale (1): Il plasmodio quando sta nell’uomo sta nel sangue (necessario per la sua trasmissione alla zanzara), ma è ‘nascosto’ all’interno delle cellule (epatociti prima e gl.rossi poi) La prima fase (quando comunque non sarebbe trasmissibile alla zanzara) è epatica  notevole amplificazione (40 000x) senza mai uscire dalla cellula (epatocita  cellula di grandi dimensioni e che esprime poche molecole MHC-I) La fase sessuata si svolge nella zanzara (sistema immunitario meno efficiente di quello dell’uomo)

ESEMPI di ADATTAMENTI del PLASMODIO all’UOMO Alcuni aspetti del suo ciclo vitale (2): P.ovale e P.vivax sono diffusi anche in climi temperati e presentano recidive a distanza di 8-9 mesi  necessità di adattarsi alla presenza stagionale della zanzara P.malariae presenta recidive anche a distanza di anni  la sua presenza risale ad epoche molte antiche quando le comunità umane erano molto piccole e distanti tra di loro

P. falciparum è una specie abbastanza recente (ca P.falciparum è una specie abbastanza recente (ca. 10 000 anni), si è potuta evolvere grazie alle condizioni ambientali e demografiche che si sono venute a creare con la nascita dell’agricoltura: Espansione demografica  non è necessario ‘tenersi caro’ l’uomo Passaggio a uno stile di vita sedentario e formazione di comunità ad alta densità abitativa = condizioni di facile trasmissibilità Nascita di condizioni ambientali favorevoli allo sviluppo delle zanzare (pozze di acqua derivanti dall’irrigazione delle coltivazioni) Durante il suo sviluppo endo-eritrocitario il plasmodio produce un catabolita dell’Hb che è tossico per i macrofagi (emozoina) Sequestro dei gl.rossi infettati  viene evitato il passaggio nella milza  esposizione di proteine non self  variazione antigenica

P.falciparum Adattamento a un adattamento culturale dell’uomo: l’uso di farmaci antimalarici, quali clorochina e artemisina, ha provocato la selezione di ceppi di plasmodio resistenti

Wellems et al. 2009 – J Clin Invest Diminuzione della mortalità da malaria in Africa grazie all’introduzione della clorochina e successivo aumento dovuto alla comparsa di ceppi clorochina-resistenti

Perché P.falciparum è diffuso prevalentemente in Africa e la sua eradicazione risulta così difficile ? Fattori climatici (presenza annuale e non stagionale dell’insetto vettore e temperature ideali per lo sviluppo del plasmodio nella zanzara, 17-30°C) Le specie di Anopheles presenti sono molto antropofiliche (agricoltura in assenza di allevamento) Le modificazioni ambientali create dall’uomo sono molto favorevoli allo sviluppo della zanzara

.....e la zanzara ? nemica o alleata nella lotta al plasmodio ?

Le ‘mosse’ dell’uomo Adattamenti genetici  numerosi ma in genere poco efficienti (in termini di percentuale di individui protetti) Caratteri che alterano i gl.rossi rendendoli meno ‘ospitali’ per il plasmodio, se però vengono ereditati da entrambi i genitori le alterazioni a carico dei gl.rossi sono talmente gravi da comprometterne la funzione  diffusione limitata Un adattamento ‘perfetto’ (o quasi): l’assenza di Ag Duffy Caratteri che rendono il sistema immunitario più efficiente Caratteri che diminuiscono la probabilità di essere punti dalle zanzare

Le ‘mosse’ dell’uomo Adattamenti culturali  numerosi sia contro il plasmodio che contro la zanzara, ma entrambi sono stati, e sono tuttora, molto efficienti nel neutralizzarli Nel periodo 2000-2010 l’uso di tende impregnate di insetticida e di nuovi farmaci antimalarici ha fatto calare del 17% i casi clinici e del 26% la mortalità, tuttavia ci attendiamo (e in parte già sono state osservate) ‘contromosse’ da parte sia del plasmodio che della zanzara