Aurelia Di Taranto, Marco Iammarino Struttura Complessa “Chimica” SVILUPPO DI UN METODO RAPIDO PER LA DETERMINAZIONE SIMULTANEA DI SETTE ADDITIVI ALIMENTARI NEI PRODOTTI LATTIERO-CASEARI MEDIANTE CROMATOGRAFIA IONICA E RIVELAZIONE CONDUTTIMETRICA Aurelia Di Taranto, Marco Iammarino Struttura Complessa “Chimica” Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata - Foggia INTRODUZIONE I prodotti lattiero-caseari sono substrati caratterizzati da parametri chimico fisici che rendono possibile lo sviluppo solo di pochi generi di microorganismi. È per questo motivo che l’attuale Normativa Europea ammette l’impiego di pochi additivi alimentari in questa tipologia di prodotti. Tra questi troviamo tre regolatori di acidità: acido lattico, acido acetico e fosfati; e tre conservanti: acido sorbico, acido benzoico e nitrati (con diverse limitazioni); i nitriti non sono ammessi (Direttiva 95/2/CE [1]). Non sono disponibili attualmente tecniche analitiche che consentano la determinazione simultanea di questi additivi nei prodotti lattiero-caseari. Tali tecniche risultano necessarie per i laboratori preposti al controllo ufficiale dei prodotti alimentari per poter verificare l’assenza di additivi, nel caso in cui questi non siano consentiti, e/o il rispetto dei limiti definiti nella Normativa Comunitaria. In questo lavoro è stata sviluppata una metodica analitica capace di determinare sette additivi alimentari (acido sorbico, acido benzoico, acido lattico, acido acetico, nitriti, nitrati e fosfati) nei prodotti lattiero-caseari. Tale metodica sfrutta la cromatografia ionica abbinata alla rivelazione elettrochimica conduttimetrica. RISULTATI L’applicabilità del metodo di analisi proposto in questo lavoro è stata verificata valutando una serie di performances facendo riferimento al Regolamento 882/2004/CE ed ai protocolli riportati nella Decisione 657/2002/CE [3]. Sono stati esaminati i seguenti parametri: Specificità. È stata effettuata questa valutazione analizzando un numero statisticamente significativo di prodotti lattiero-caseari dichiarati in etichetta “senza conservanti aggiunti” (5 campioni di mozzarelle, 5 campioni di formaggi spalmabili, 5 campioni di formaggi a media maturazione e 5 formaggi a lunga stagionatura). Grazie a queste 20 prove si è potuta verificare l’assenza di interferenti significativi nell’intorno di tolleranza massima accettata per i tempi di ritenzione relativa agli analiti rispetto ad un campione fortificato (+/- 2.5%). Linearità. Mediante questa verifica è stato determinato il range di linearità strumentale e, quindi, il campo di misura; inoltre è stato possibile valutare i parametri della regressione lineare ottenuta dall’elaborazione dei dati ottenuti, sia in termini di coefficiente di correlazione lineare, che di pendenza e di intercetta della retta (Tab.2). La soluzione madre con i sette additivi e le relative diluizioni sono state formulate solubilizzando gli standard in polvere in NaOH 8.5 · 10-3 M. Limiti di Decisione. Elaborando i dati utilizzati per le costruzioni delle singole rette di taratura, così come descritto da Miller & Miller [4], sono stati calcolati i valori del limite di determinazione (LOD) e del limite di quantificazione (LOQ) dei singoli additivi (Tab.2). Recupero e Precisione. Mediante 6 prove di additivazione dei 7 additivi, ripetute su un formaggio a media maturazione, è stata stimata l’accuratezza del metodo. In tabella 4 sono riassunti i dati relativi alle prove di additivazione. I valori di CV% (<10.9%) hanno dimostrato una buona precisione del metodo mentre l’esattezza è comprovata dalle percentuali di recupero ottenute, comprese tra il 72.8% ed il 98.4% Robustezza. Seguendo l'approccio di Youden [5], operando in condizioni di “major changes”, si è verificata l’omogeneità dei risultati ottenuti su diverse tipologie di prodotti lattiero-caseari (4 campioni di mozzarelle, 4 campioni di formaggi spalmabili e 4 campioni di formaggi a lunga stagionatura), additivati alle stesse concentrazioni utilizzate per le prove di precisione e recupero. MATERIALI E METODI La prima di fase della metodica è quella di estrazione e purificazione dei campioni. L’estrazione viene eseguita su 5g di campione, previamente omogeneizzato, pesati in falcon da 50 mL, con 20 ml di NaOH 8.5 · 10-3 M, dapprima in bagno ad ultrasuoni per 10 minuti, quindi mediante agitazione su vortex per un minuto. Si effettua una centrifugazione a 3000 rpm per 10 minuti a 4°C, quindi circa 5 ml del surnatante vengono filtrati con filtri da 0.2 µm. È infine prevista un’ultima fase di purificazione, necessaria per rimuovere l’eccesso di cloruri presenti; tale passaggio viene effettuato su 1 ml di filtrato, mediante cartucce OnGuard II Ag (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA) previamente attivate con 1 ml di acqua ultrapura. Il campione così ottenuto è pronto per l’analisi mediante HPIC: Cromatografo ionico Dionex DX500 (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA), colonna a scambio anionico IonPac AS9-HC 4x250 mm, soppressore ASRS ultra II self-regenerating settato a 50mA, PC e software per l’elaborazione dei dati. L’eluizione prevede un gradiente di Na2CO3: da 0.9 mM a 3.7 mM in 5 minuti, fino a 9.2 mM in 1 minuto, costante per 19 minuti, fino a 28.5 mM in 1 minuto, costante per 4 minuti, quindi una fase di riequilibrio di 10 minuti a 0.9 mM. Tale gradiente è stato ottimizzato in modo tale da poter ottenere una buona separazione dei sette additivi (Fig. 1), ottenendo al tempo stesso una buona simmetria dei picchi cromatografici ed una netta separazione dai picchi di matrice interferenti. Le principali performances analitiche del metodo ottimizzato sono state valutate in accordo con il Regolamento della Commissione Europea N. 882/2004 [2]. Additivo Linearità (r2) LOD in matrice (mg · kg-1) LOQ Campo di misura in matrice Recupero % CV% Specificità Acido Lattico 0.992 0.6 1.9 1.9 – 400 92.3 9.4 - Acido Acetico 0.998 3.6 11.9 11.9 – 400 79.6 3.0 Assenza interferenti Acido Sorbico 0.990 59.4 196.0 196 – 8000 72.8 10.2 Ione Nitrito 0.994 2.8 9.3 9.3 – 400 78.6 10.3 Acido Benzoico 0.999 16.5 54.5 54.5 – 4000 95.0 7.0 Ione Nitrato 0.997 2.1 6.8 6.8 – 400 88.1 10.9 Ione Fosfato 7.0 - 400 98.4 8.5 Fig. 1 – Tipico cromatogramma relativo all’iniezione di una miscela dei 7 additivi oggetto di studio: 1 – Acido Lattico; 2 – Acido Acetico; 3 - Acido Sorbico; 4 - Ione Nitrito; 5 – Acido Benzoico; 6 – Ione Nitrato; 7 – Ione Fosfato Tab. 1 – Principali parametri di validazione CONCLUSIONI La metodica analitica presentata in questo lavoro consente la determinazione di 7 additivi alimentari (acido sorbico, acido benzoico, acido lattico, acido acetico, nitriti, nitrati e fosfati) nei prodotti lattiero-caseari mediante la cromatografia ionica abbinata alla rivelazione elettrochimica conduttimetrica. L’ottimizzazione del gradiente di eluizione ha permesso la separazione cromatografica dei sette additivi oggetto di studio. I parametri di validazione studiati (specificità, linearità, limiti di decisione, precisione, recupero e robustezza) hanno dimostrato l’accuratezza e l’applicabilità del metodo a tutte le tipologie di prodotti lattiero-caseari. Fig. 2 – Confronto tra cromatogrammi ottenuti per campioni normali (a) e fortificati con i 7 additivi (b): 1: Formaggio stagionato; 2: Formaggio spalmabile; 3: Formaggio a maturazione media; 4: Formaggio fresco a pasta filata BIBLIOGRAFIA 1) European Parliament and Council. “Directive No 95/2/EC of 20 February 1995 on food additives other than colours and sweeteners”. Journal of the European Union 1-53. 1995; 2) European Commission. “Regulation (EC) No. 882/2004, 29 April 2004”. Journal of the European Union, L165. 1–141. 2004; 3) European Commission. “Decision (EC) No. 657/2002, 12 agosto 2002”. Journal of the European Union, L221. 8–36. 2002; 4) E.J.C. Miller & J.N. Miller. “Statistics for Analytical Chemistry (3rd ed.)”. New York, NY, USA: Ellis Horwood PTR Prentice Hall. 115. 1993; 5) W.J. Youden, E.H. Steiner. “StatisticalManual of the AOAC—Association of the Official Analytical Chemists”. AOAC-I, Washington, DC. 35. 1975