Crioconservazione di ovociti ed embrioni Scuola di Specializzazione in Fisiopatologia della Riproduzione negli Animali Domestici Corso di Biotecnologie della Riproduzione (AA 2016/17) Crioconservazione di ovociti ed embrioni

Sommario (1) Definizioni e riferimenti storici Vantaggi della conservazione e criopreservazione Conservazione embrioni prodotti in vivo/vitro Sviluppo di procedure di congelamento Crioproteggenti di uso comune Strumentazioni per il congelamento Protocolli di congelamento embrioni prodotti in vivo/vitro Valutazione qualità embrionaria

Sommario (2) Congelamento dell’ovocita Uso dell’ovocita primario e secondario Congelamento dello zigote (2PB2PN) Congelamento rapido e ultrarapido Vitrificazione Vitrificazione embrioni prodotti in vivo/vitro Vitrificazione di ovociti

Definizioni Conservazione ipotermica Congelamento Vitrificazione Temperature non inferiori a 0°C, metodo per conservazione a breve termine. Evita stress osmotici e danni derivanti da esposizione ai crioprotettori. Congelamento Temperature inferiori a 0°C; si ha formazione di cristalli di ghiaccio. Vitrificazione Una miscela di crioprotettori solidifica per aumento estremo della viscosità durante il raffreddamento. Non si ha formazione cristalli di ghiaccio.

Riferimenti storici 1952 Polge Congelamento seme bovino 1971 Wittingham Congelamento embrioni di topo (progenie da embrioni congelati) 1973 Wilmut & Rowson Nascita primo vitello da embrione congelato 1978 Willadsen Congelamento embrioni two steps 1984 Leibo Congelamento embrioni one step 1985 Rall & Fahy Vitrificazione 1986 Heyman Congelamento ovocita primario 1992 Arav - Vitrificazione embrioni ed ovociti - Glicoproteine antifreezing

Vantaggi della conservazione e criopreservazione Diffusione ed applicazione commerciale dei prodotti delle tecnologie di fecondazione assistita; Per la commercializzazione di embrioni animali: controllo del rischio di trasmissione delle malattie infettive; Nel caso della conservazione: riduzione dei danni e perdite provocati ai campioni nelle procedure di congelamento.

Conservazione Conservazione embrioni prodotti in vivo Embrioni bovini prodotti in vivo possono essere conservati a temperatura di refrigerazione (4°C) per 24h o anche più a lungo Conservazione embrioni prodotti in vitro Esistono fondamentali differenze cellulari e molecolari fra embrioni prodotti in vivo ed in vitro per cui le temperature di refrigerazione hanno effetti deleteri su questi; morule IVMFC-derivate non sopravvivono al di sotto di 15°C

Sviluppo di procedure di congelamento/scongelamento Miglioramenti nel settore della crioconservazione sono continuativi con obiettivi di incremento dell’ efficacia e della semplicità (ricerca di base e applicata) Metodi Slow-Freezing derivati dalla ricerca sugli effetti del congelamento e dello scongelamento di cellule di mammifero Metodi di Vitrificazione miranti ad ottenere formazione di vetro piuttosto che di critalli di ghiaccio intracellulare formati da acqua e crioproteggenti

Crioproteggenti di uso comune Sostanze di diversa natura chimica, caratterizzate da elevata solubilità in acqua che stabilizzano la struttura delle membrane con azione sulle componenti lipoproteiche. CRP diffusibili: -dimetilsulfossido (DMSO) -metanolo -glicole etilenico (EG) -glicole propilenico (GP) -glicerolo CRP non diffusibili: -saccarosio -polivinilpirrolidone (PVP) -trealosio Antifreeze glycoproteins Combinazione di agenti crioprotettivi

Ruoli dei crioproteggenti Prevenire danni cellulari (citoscheletro e membrane) Ridurre il punto di congelamento della soluzione Far avvenire la disidratazione prima della formazione dei cristalli di ghiaccio

Strumentazioni per il congelamento Congelatori programmati Contenitori: Paillettes Cryovials Cryoloops Celle termoelettriche controllate mediante computer

Fasi delle tecniche di congelamento embrioni Aggiunta del crioproteggente Caricamento in contenitori Raffreddamento controllato Induzione della cristallizzazione Congelamento Stoccaggio in azoto liquido Scongelamento Rimozione del crioproteggente

Protocollo congelamento blastocisti bovine Selezione morfologica degli embrioni Equilibratura degli embrioni in freezing medium (es: PBS con 0.4%BSA e 10% glicerolo) Preparazione paillettes Raffreddamento in congelatore programmato da T° amb. a –7 C° (–3 C°/min) Seeding Da –7 a –35 C° (– 0.3 C°/min) Plunging in azoto liquido

Procedura one step Schema pag. 306

Protocollo congelamento embrioni umani (cleavage stage) PROH e saccarosio in HTF-HEPES + 20% siero materno inattivato a 56°C 1.5 mol/l PROH per 10’ a temp ambiente 1.5 mol/l PROH e 0.2 mol/l saccarosio Caricamento in straws Freezer programmabile: - (-2°C/min) fino a -7°C - seeding - (-0.3°C/min) fino a -30°C - (-50°C/min) fino a -150°C Plunging in azoto liquido Jerico et al., 2003 Hum Reprod 18:568-571.

Congelamento embrioni prodotti in vitro e manipolati Embrioni prodotti in vitro sono molto più sensibili alle procedure di congelamento rispetto agli embrioni bovini Effetti dei sistemi colturali in vitro sulla resistenza alle procedure di congelamento Embrioni prodotti da ICSI Embrioni sottoposti a biopsia

Valutazione qualità embrionaria prima e dopo il congelamento Prima del congelamento Valutazione qualità embrionaria Stadio dello sviluppo Embryo grading (normativa IETS/ESHRE) Dopo scongelamento Hatching della zona pellucida come indicazione di qualità embrionaria

Schema valutazione embrioni bovini (Normativa IETS IETS Manual 3rd edition)

Congelamento dell’ovocita Whittingham (1972) Congelamento zigoti ed embrioni Whittingham (1977) Congelamento ovociti ovulati Glenister (1987) Embrioni ottenuti da IVF di ovociti congelati, scongelati e coltivati in vitro Shellander (1988) Congelamento di ovociti immaturi Fuku (1992) Nascita di gemelli da IVF di ovociti congelati Hamano et al., (1992) Prima vitrificazione di ovocita bovino Otoi et al., (1996) Nascita di vitello da ovocita criopreservato

Congelamento dell’ovocita Congelamento dell’ovocita allo stadio pronucleare Congelamento dell’ovocita primario e secondario

Protocollo per ovociti Fase I: congelamento Ruppert-Lingham 2003 Hum Reprod 18:392-398. Ovociti in microgocce da 30 ml di terreno di IVM + 0.1 mg/ml dcAMP Passaggio in mezzo di crioconservazione: - 1.5 mol/l DMSO in PBS + 10% FCS e 0.1 mg/ml dcAMP (sol.A) 5’ esposizione a 0°C pipettare in 15-20 ml della soluzione in una straw contenente 0.1 mol/l saccarosio in sol A (20 COCs/straw) raffreddamento (–2 C°/min) da 4° C fino a –6 °C mantenere a –6 °C per 10 min Seeding Continuare raffreddamento (-0.3°C/ min) da –6°C a –60°C Plunging in azoto liquido

Fase II: Scongelamento Rimuovere la straw dall’azoto liquido e porla in congelatore programmato a –70°C Riscaldare fino a 4°C (8°C/min) Flushing della straw con 1 ml 0.1 mol/l saccarosio in PBS +10%FCS + 0.1 mg/ml dcAMP in una piastra per coltura 5 min a temperatura ambiente in PBS +10%FCS + 0.1 mg/ml dcAMP Piastra riscaldante a 37°C per 5 min Valutazioni e inserimento in protocollo di IVM

Fattori che influenzano l’efficienza di una metodica di congelamento Velocità di diffusione transmembrana del CRP Coefficiente di permeabilità dell’embrione nei confronti del CRP Gradiente di concentrazione intra-extracellulare del CRP Temperatura di esposizione Superficie dell’embrione Stadio di sviluppo embrionario Tempo di esposizione Aggiunta di sostanze non permeabili disidratazione cellulare riduzione della formazione di cristalli di ghiaccio.

Vitrificazione La vitrificazione è un procedimento di crioconservazione attraverso il quale si elimina il congelamento di una soluzione, con conseguente eliminazione degli effetti avversi della formazione dei cristalli di ghiaccio Consiste in un processo di solidificazione nel quale si verifica un repentino incremento della viscosità del medium che produce una condizione simile al vetro L’esposizione alla soluzione di vitrificazione deve essere molto breve per evitare effetti dannosi dovuti alla tossicità dei crioproteggenti. Il riscaldamento deve essere altrettanto rapido per evitare formazione di cristalli al risalire della temperatura

Vitrificazione di embrioni prodotti in vivo/vitro e ovociti bovini Vitrificazione di embrioni bovini prodotti in vivo (Massip et al., 1986; Arav, 1992) Vitrificazione di embrioni prodotti in vitro (Tachikawa et al., 1993) Vitrificazione di ovociti bovini (Hamano, 1992)

Cryoloops e caricamento degli embrioni

Vitrificazione di blastocisti umane Mukaida et al., 2003 Hum Reprod 18:384-391. Un cryoloop consiste in un loop in nylon (20 m calibro e 0.5-0.7 mm diametro) montato su un tubo di acciaio inossidabile inserito a sua volta sul coperchio di una cryovial In ogni cryoloop possono essere vitrificate da 1 a 3 blastocisti dopo averle trattate con due diverse soluzioni di crioprotettori Le blastocisti vengono incubate in medium di base (hTF-HEPES+5 mg/ml hSA) contenente 7.5% DMSO e 7.5% di EG (soluzione I) Dopo 2 minuti vengono trasferite in un medium di base contenente 15% DMSO, 15% EG, 10 mg/ml Ficoll 70 e 0.65 mol/l saccarosio (soluzione II) In questa fase le soluzioni crioproteggenti e la piastra riscaldante del microscopio sono mantenuti a 37°C Le blastocisti vengono passate nella soluzione II, caricate nella cryoloop pre-lavata con soluzione II e rapidamente immerse in azoto liquido.

Vitrificazione di ovociti umani Hong et al., 1999. Fertil Steril 72:142-146. - Dulbecco PBS + 1.5M EG (temperatura ambiente per 5 min) - Dulbecco PBS + 5.5M EG e 1 M saccarosio (temperatura ambiente per 20 sec) - montaggio su EM grids - plunging in azoto liquido Ottimi risultati

Letture consigliate “Preservation of embryos and oocytes” in Gordon I. “Laboratory production of Cattle embryos” CAB International Dublin 2003 Chap. 8. Articolo Seren et al., 1996 (Atti RAIZ) Articolo Parmigiani et al., 1999 (Summa) N° 4 Articoli segnalati: Hong et al., 1999. Fertil Steril 72:142-146. Mukaida et al., 2003 Hum Reprod 18:384-391. Ruppert-Lingham 2003 Hum Reprod 18:392-398. Jerico et al., 2003 Hum Reprod 18:568-571.