LA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI LA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI DIFFERISCE DA QUELLA DEI PROCARIOTI PER 4 ASPETTI FONDAMENTALI I batteri hanno un solo tipo di RNA Polimerasi mentre gli Eucarioti ne hanno 3 che riconoscono promotori strutturalmente differenti tra loro La RNA Polimerasi eucariotica NON è in grado di dare inizio alla trascrizione senza l’ausilio di altre proteine (fattori generici di trascrizione) Proteine regolatrici (repressori o attivatori) possono legare il DNA in regioni distanti anche centinaia di basi dal promotore L’inizio della trascrizione in Eucarioti deve tenere in conto lo stato di organizzazione del DNA in nucleosomi e la compattezza della struttura cromatinica

LE RNA POLIMERASI EUCARIOTICHE Le cellule eucariotiche ne hanno 3*: le RNA Pol I, Pol II e Pol III. La RNA Pol II è responsabile della trascrizione della maggior parte dei geni, inclusi quelli codificanti proteine, e alcuni piccoli RNA nucleari (U1, U2, U4, U5) . La RNA Pol I, localizzata nel nucleolo, trascrive il gene per il precursore degli RNA ribosomiali (40% dei trascritti totali), La RNA Pol III trascrive i geni per i tRNA, alcuni piccoli RNA nucleari (es. U6) e l’RNA ribosomiale 5S. (*) Nella cellula eucariotica esistono altre RNA polimerasi : l’RNA polimerasi mitocondriale e l’RNA polimerasi dei cloroplasti

Le tre RNA pol eucariotiche sono grandi proteine Alcune subunità sono comuni a tutte e tre le polimerasi La subunità più grande della Pol II ha un CTD che è fosforilato durante l’inizio della trascrizione Hanno posizioni diverse nel nucleo, corrispondenti ai geni che trascrivono RNA pol I localizzata nel nucleolo RNA pol II e III sono localizzate nel nucleoplasma L’ enzima purificato può effettuare la trascrizione ma è incapace di inizio selettivo a livello dei promotori La selettività viene controllata da specifiche proteine (Fattori generici) che si legano a specifiche sequenze del DNA

Una proteina regolatrice di geni si lega al solco maggiore I regolatori genici sono proteine che presentano configurazioni ricorrenti particolarmente adatte a legare il DNA “elica-ansa-elica” “zinc finger” “cerniera a leucina” Una proteina regolatrice di geni si lega al solco maggiore Generalmente all’interfaccia proteina –DNA si stabiliscono 10-20 contatti che interessano ciascuno un’ a.a. diverso e contribuiscono tutti a rafforzare l’interazione

Gli enhancer e i silenziatori sono elementi di DNA indipendenti per posizione e orientamento che stimolano o inibiscono, rispettivamente, la trascrizione di geni associati.

ENHANCERS Il tratto di DNA che separa l’enhancer dal promotore può essere di parecchie kb Funzionano sia da enhancer che da silencer a seconda della proteina che vi si lega Sono anche tessuto-specifici per il fatto che richiedono per la loro attività proteine tessuto-specifiche che legano il DNA

Il DNA tra intensificatore e promotore forma un’ansa Le Proteine Regolatrici controllano l’espressione genica a distanza ENHANCERS Gli Attivatori agiscono favorendo l’assemblaggio dei fattori generici e dell’ RNA Pol I Repressori fanno il contrario Il DNA tra intensificatore e promotore forma un’ansa La proteina che lega l’enhancer prende contatto con le proteine che legano il promotore (RNA polimerasi e Fattori generici) Il complesso proteico del MEDIATORE fa da connessione tra tutte le proteine

codice che è letto dalle proteine coinvolte nell’espressione genica L’IMPACCHETTAMENTO DEL PROMOTORE IN NUCLEOSOMI PUO’ INFLUENZARE L’INIZIO DELLA TRASCRIZIONE codice che è letto dalle proteine coinvolte nell’espressione genica Nucleosomi acetilati = DNA trascrizionalmente attivo Acetilazione delle Lisine Eliminazione di cariche positive = minore affinità x il DNA l’aggiunta del gruppo acetile fa perdere la carica positiva all’estremita’ NH3 delle lisine e come conseguenza fa perdere affinita’ agli istoni x il DNA Nucleosomi deacetilati = DNA trascrizionalmente inattivo Deacetilazione delle Lisine Ripristino di cariche positive = ripristino di affinità x il DNA Watson pag 168 l’aggiunta del gruppo acetile (C = O ---CH3) fa perdere la carica positiva all’estremita’ NH3 delle lisine e come conseguenza fa perdere affinita’ agli istoni x il DNA

I repressori attraggono le DEACETILASI L’IMPACCHETTAMENTO DEL PROMOTORE IN NUCLEOSOMI PUO’ INFLUENZARE L’INIZIO DELLA TRASCRIZIONE Il DNA è normalmente impaccato nei nucleosomi e nella cromatina. L’organizzazione della cromatina potrebbe essersi evoluta proprio per evitare l’espressione genica casuale Pertanto, l’inizio della trascrizione in vivo richiede l’intervento di enzimi che rimodellano la cromatina. Attivatori e repressori in eucaroti attraggono proteine che modulano la struttura della cromatina modificando l’accessibilità del promotore ai fattori di trascrizione e alla RNA Pol Proteine attivatrici attraggono le ACETILASI che aggiungono un gruppo acetile alle lisine delle code istoniche destrutturando la cromatina e rendendo accessibile il DNA I repressori attraggono le DEACETILASI

Facilitates chromatin transcription Le Polimerasi in fase di allungamento devono risolvere il problema degli Istoni FACT Facilitates chromatin transcription

La RNA Polimerasi eucariotica NON è in grado di dare inizio alla trascrizione senza l’ausilio di altre proteine (fattori di trascrizione) Ogni RNA Polimerasi eucariotica funziona in associazione di una propria serie di fattori di trascrizione In tutti i promotori eucariotici il primo passaggio dell’inizio della trascrizione consiste nel legame di un fattore di posizionamento Ogni classe di RNA Polimerasi è assistita nel legame al DNA da un proprio fattore di posizionamento costituito dalla piccola proteina TBP associata ad altri componenti

TBP (TATA binding protein) è la proteina che lega la TATA box TBP (TATA binding protein) è la proteina che lega la TATA box. La distorsione del DNA richiama altri fattori generici di trascrizione

RNA Polimerasi I Il promotore della RNA Pol I è dedicato alla espressione di un singolo gene (presente nel genoma in copie multiple in tandem): il precursore degli rRNA, il cui livello di espressione è molto più alto di quello di tutti gli altri geni. L’RNA ribosomale è la più abbondante e stabile forma di RNA nelle cellule Il promotore di Pol I consiste di due regioni separate: il nucleo del promotore l’UPE(upstream promoter element). Aumenta la forza del promotore L’UPE lega due fattori: UBF e SL1 UBF lega l’UPE a livello del solco minore costingendo il DNA ad una rotazione di 360° Nucleo e UPE si avvicinano È reclutato SL1 (un complesso di 4 proteine tra cui il fattore TBP) TBP lega il nucleo e posiziona correttamente l’RNA Pol sul sito di inizio (COMPLESO DI PRE INIZIO)

GENE PRECURSORE DELL’rRNA La presenza di tre geni diversi per gli rRNA all’interno di un’unica unità di trascrizione assicura che la cellula produca questi tre rRNA in uguale quantità. Molti genomi eucariotici possiedono copie multiple di unità di trascrizione per il pre-rRNA, organizzate in “blocchi” di ripetizioni (ripetizioni in tandem), separati da DNA spaziatore che non viene trascritto. Dopo che l’unità di trascrizione è stata trascritta dall’RNA polimerasi I, la molecola di pre-rRNA subisce un processo di maturazione nel nucleolo che prevede diverse reazioni di taglio per rilasciare gli rRNA maturi e rimuovere le sequenze spaziatrici Il processo di taglio del pre-rRNA è guidato da un particolare gruppo di molecole di RNA, gli snoRNA (small nucleolar RNA), presenti all’interno del nucleolo.

Processamento del precursore dell’rRNA 45S umano Il processo avviene nel nucleolo dove sono prodotti gli rRNA e dove sono assemblati i ribosomi 5 FASI Viene rimossa l’estremità 5’ Un taglio al centro genera 2 precursori: 20S e 32S Il precursore 20S è rosicchiato al 3’ fino alla taglia delle giuste dimensioni Il precursore 32 viene tagliato per liberare gli rRNA 5,8S e 28 S Gli rRNA 5,8S e 28 S si associano x appaiamento di basi

RNA Polimerasi III I promotori della RNA Pol III possono avere strutture differenti. Due classi generali di promotori che sono riconosciuti da gruppi diversi di fattori TIPO 1 e 2 posizionati a valle del sito di inizio della trascrizione, sono detti interni e sono i geni degli RNA 5S e dei tRNA I promotori dei geni dei piccoli RNA nucleari (snRNA) Si trovano a monte del punto di inizio

RNA Polimerasi III i geni dei tRNA TFIIIC lega le box A e B Viene reclutato TFIIIB che si lega al punto di inizio Il fattore TBP posiziona correttamente l’RNA Pol (COMPLESO DI PRE INIZIO)

RNA Polimerasi III i geni degli RNA 5S TFIIIA si lega alla box A TFIIIC si lega alla boxC Viene reclutato TFIIIB che si lega al punto di inizio Il fattore TBP posiziona correttamente l’RNA Pol (COMPLESO DI PRE INIZIO) TFIIIA e TFIIIC sono detti fattori assemblaggio perché il loro unico ruolo è quello di facilitare il legame di TFIIIB nella posizione giusta Dopo il legame di TFIIIB al promotore TFIIIA e TFIIIC si allontanano

RNA Polimerasi III I promotori dei geni dei piccoli RNA nucleari (snRNA) Viene reclutato TFIIIB che si lega alla TATA box Il fattore TBP posiziona correttamente l’RNA Pol (COMPLESO DI PRE INIZIO) TATA elemento necessario e sufficiente PSE e Oct aumentano l’efficienza trascrizionale

RNA Polimerasi II Sequenze regolatrici Le sequenze regolative sono raggruppate in diverse categorie, a seconda della loro localizzazione, e dell’organismo in funzione Sequenze regolatrici BRE elemento di riconoscimento per il TFIIB TATA box elemento di riconoscimento per il TBP Inr iniziatore elemento di riconoscimento per il TFIID DPE elemento promotore a valle I promotori naturali di classe II possono essere privi di uno o più di questi elementi e funzionare ancora

a monte della TATA box……………. +1 promotore GC CAAT GC TATA -95 -80 -50 -25 TATA box (TATAAAA) localizzata circa 25-30 bp a monte del sito di inizio +1 determina l’esatta posizione del punto di inizio lega la TATA binding protein (TBP) che è una subunità del fattore TFIID GC box (CCGCCC) lega Sp1 (Specificity factor 1) CAAT box (GGCCAATCT) lega CTF (CAAT box transcription factor) This figure shows the regulatory elements for a "typical" eukaryotic gene (compare this to the E. coli promoter). There is a TATA box located approximately 25-30 bp upstream of the start site. It interacts with the TATA binding protein and determines the exact site of initiation. A little further upstream are two GC boxes (in inverted orientation with respect to each other) and a CAAT box. These promoter elements are all consensus sequences. Still further upstream is an octomer element. Transcription factors specific to each of these elements function by recognizing these DNA sequences and binding to these DNA sites.

Il complesso di inizio si forma sui promotori grazie all’assemblaggio dei fattori di trascrizione in una sequenza ordinata L’insieme dei GTF, la RNA polimerasi e il promotore formano il complesso di pre-inizio (PIC). Il principale fattore di trascrizione della RNA Pol II è TFIID (TPB +TAFs). Il legame di TBP al DNA ne induce una marcata distorsione e consente il reclutamento di altri fattori GTF e della stessa RNA polimerasi. L’apertura dei due filamenti a livello del promotore richiede l’intervento di TFIIH e l’idrolisi di ATP. TFIID

Scatole Cinesi Identificare i confini di una regione di L’rRNA 5S viene trascritto ad opera della RNA polimerasi III Scatole Cinesi Identificare i confini di una regione di controllo trascrizionale Idrolisi con un’endonucleasi Digestione con Bal 31 Controllo del quantitativo di DNA rimosso variando il tempo, la temp e la conc dell’enzima usato

TFIIH è un fattore eccezionale con diverse attività: Il distacco dal promotore richiede la fosforilazione della “coda” della Polimerasi Il passaggio dall’inizio abortivo alla fase di allungamento è segnato dalla fosforilazione della coda CTD (C-terminal domain) dell’enzima TFIIH è un fattore eccezionale con diverse attività: ATPasica Elicasica Chinasica È coinvolto nel riparo del DNA La fosforilazione della coda del CTD facilita l’evasione della polimerasi dal promotore. La fosforilazione del CTD è necessaria per iniziare la trascrizione

ALLUNGAMENTO DELLA TRASCRIZIONE La fosforilazione del CTD, che avviene in concomitanza con l’inizio della fase di allungamento, provoca uno scambio tra i fattori di inizio e quelli necessari per l’allungamento e la maturazione dell’RNA.