RIPRODUZIONE NEL BUFALO Prof Giovanni Michele Lacalandra

Bubalus bubalis La specie bufalina è caratterizzata da: Notevole rusticità Grande produttività Notevole efficienza riproduttiva Elevati incrementi ponderali (Nogueira et al., 1989b; Baruselli et al., 1993; Oliveira et al., 1994; Villares, 1994)

Anatomia degli organi riproduttivi della femmina di bufalo

La struttura e la dislocazione degli organi riproduttivi interni sono simili a quelli dei bovini; il clitoride è più sviluppato; le corna uterine e le ovaie sono di dimensioni più ridotte rispetto a quelle dei bovini La densità follicolare ovarica è ridotta nei bufali rispetto ai bovini (20.000 vs 50.000 follicoli)

Aspetti riproduttivi Pubertà 15-18 mesi Prima Gravidanza 250-275 Kg Specie poliestrale stagionale a fotoperiodo negativo Stagione riproduttiva (Italia) Settembre- Febbraio

Rilevamento dell’estro e ovulazione

Rilevamento dell’estro e ovulazione L’estro, nel bufalo, è meno prevedibile e meno intenso rispetto ai bovini; scarso numero di bovine che si montano l’un l’altra in fase di accettazione del maschio difficoltà riconoscimento estro La sua durata varia al variare dell’area geografica e della latitudine di rilievo; Brasile durata media estro: 14±7 ore; ovulazione circa 16 ore dopo la fine dell’estro Italia durata media estro: 20 ore; ovulazione circa 50 ore dopo inizio estro (Baruselli, 1994; Seren e Parmeggiani, 1997)

Rilevamento dell’estro e ovulazione

NUOVO SISTEMA DI RILEVAZIONE DELL’ESTRO Il sistema (HEATWATCHA ; DDx Inc., Boulder, Colorado, USA) è un sistema radiotelemetrico in grado di rilevare l’estro tramite un sensore collocato sulla schiena delle bufale e in grado di inviare delle onde segnale via radio ad un sistema computerizzato. (Walker et al., 1996; Rocha et al., 1999 )

ALCUNI PARAMETRI RIPRODUTTIVI DEI BUFALI media Ciclo estrale (gg.) 21 Durata dell’estro (h) 11.8 ± 5.6 (45)* Inizio estro-ovulazione (h) 30.0 ± 4.9 (44) Fine estro-ovulazione (h) 17.9 ± 4.1 (43) Numero di monte per estro 24.6 ± 18.2 (45) Durata delle monte (sec) 3.6 ± 0.7 (45) Durata totale delle monte (sec) 94.2 ± 80.7 (45) ( ) i numeri tra parentesi rappresentano il numero di animali osservati.

ESTRO: scolo vulvare trasparente e filante

L’intervallo tra l’inizio dell’estro ed il picco di LH è in media di 3 L’intervallo tra l’inizio dell’estro ed il picco di LH è in media di 3.6 ± 3.4 ore (Avenell et al., 1985; Kanai e Shimizu, 1986; Kumar et al., 1991). L’intervallo tra il picco di LH e l’ovulazione è in media di 25.6 ± 2.6 ore. Questo intervallo è riscontrabile in molti lavori come quello di Kanai e Shimizu (1986), che riportano un intervallo di 27.7 ± 0.5 ore tra picco di LH e ovulazione (Berber et al., 1999).

Ondate di crescita follicolare

Ogni ondata di crescita follicolare è caratterizzata da: La dinamica follicolare si articola in più ondate di crescita follicolare che si avvicendano durante il ciclo estrale. Ogni ondata di crescita follicolare è caratterizzata da: reclutamento di un pool di follicoli, selezione di alcuni tra quelli reclutati ed, infine, dominanza di uno o (raramente) più follicoli (codominanza) (Savio et al.., 1988; Sirois; Fortune, 1988; Ginther et al., 1989b; Knopf et al., 1989; Driancourt, 1991; Fortune et al., 1991; Roche; Boland, 1991 Lucy et al., 1992)

Solo l’ondata follicolare che si verifica durante la fase proestro-estrale è destinata a produrre uno (o due, raro) follicolo/i dominante/i, che poi andranno incontro ad ovulazione. Le ondate follicolari che si verificano durante la fase luteale non giungono mai ad ovulazione (dati gli elevati livelli di progesterone), ma i follicoli dominanti sono destinati all’atresia (mancata perforazione)

Danell (1987), osservò che nelle giovenche di bufalo ci sono due ondate follicolari. Prima ondata: comincia il terzo giorno e continua fino al tredicesimo giorno del ciclo, mentre la seconda ondata comincia il nono giorno e procede fino alla fine del ciclo. Seconda ondata 1 3 9 13 21 Prima ondata

I più importanti lavori condotti sulla dinamica follicolare sono stati effettuati sui bovini usando la tecnica ecografica per visualizzare le ovaie. Gli ultrasuoni rendono possibile una facile e dettagliata analisi della crescita follicolare, senza la necessità di macellare animali sperimentali. (Pierson; Ginther, 1987c). Questa tecnica permette la definitiva dimostrazione dell’esistenza di ondate follicolari durante il ciclo estrale. (Savio et al., 1988; Sirois; Fortune, 1988; Ginther et al., 1989c; Mapletoft et al., 1994)

Anche per i bufali, gli studi sulla dinamica follicolare hanno ricevuto un grande ausilio, con l’avvento dell’ecografia (63,3%)

una percentuale inferiore presenta tre ondate di crescita follicolare. E’ stato osservato che il numero totale di follicoli coinvolti per ciascuna ondata follicolare è inferiore nei bufali che per i bovini Nonostante le giovenche di bufalo, come sopra anticipato, presentino due ondate di crescita follicolare e nonostante la maggior parte delle bufale oltre i due anni di età (63,3%) presenti comunque due ondate, una percentuale inferiore presenta tre ondate di crescita follicolare. In tal caso, però, la fase luteale e, quindi, l’intero ciclo estrale, è più lungo di circa di due giorni (Baruselli et al., 1997). (Pierson; Ginther, 1987a; Adams et al., 1994; Drost, 1996; Zicarelli, 1997)

CONDIZIONAMENTO ORMONALE DEI BUFALI E’ funzionale a ottimizzare il timing delle fecondazioni artificiali, o ad ottenere la superovulazione, processo necessario per la messa in atto dei programmi di Embryo-transfer.

Ai fini del condizionamento ormonale, è possibile monitorare lo sviluppo follicolare ecograficamente per trattare le femmine in prossimità del sorgere dell’ondata follicolare (Taneja et al.., 1995b). Questa procedura però risulta poco pratica in condizioni di campo (McDougall et al., 1995). Poiché non sono state osservate differenze statisticamente significative in relazione al giorno di insorgenza della prima ondata follicolare e poiché non ci sono reports in relazione all’efficienza del trattamento superovulatorio se condotto all’insorgenza della prima o della seconda ondata (Nasser et al., 1993; Adams et al., 1994), si è assunto che potrebbero essere ottenuti buoni risultati anche agendo alla prima ondata di crescita follicolare.

Un’altra via potrebbe essere la sincronizzazione delle ondate follicolari per mezzo di metodi ormonali o meccanici e iniziare il trattamento superovulatorio all’insorgenza della seconda ondata, come recentemente proposto per i bovini (Bo et al., 1995; Bo et al.., 1996) e per i bufali (Baruselli et al., 1997).

Anatomia degli organi riproduttivi del maschio

Gli organi riproduttivi sono simili a quelli del Bos bovis, ma i testicoli e lo scroto sono più piccoli. Come nei bovini i testicoli e l’epididimo possono essere palpati attraverso la parete scrotale, e la prostata, le vesciche seminali e l’ampolla del dottodeferente possono essere palpati attraverso il retto.

Pubertà La curva di accrescimento testicolare si innalza leggermente tra i 5 ed i 15 mesi, rapidamente tra i 15 ed i 25, quindi ancora lentamente tra i 25 ed i 38 mesi.

Spermatogenesi: dai 12 ai 15 mesi; Maturazione sessuale: presenza di spermatozoi mobili nell’eiaculato, dai 24-25 mesi. Tra gli animali da reddito, il bufalo presenta uno dei più brevi cicli di spermatogenesi; La durata del ciclo dell’epitelio seminifero e della spermatogenesi è di 8,6 e 38 giorni rispettivamente (Sharma et Gupta, 1980).

Testa spermatozoo di bufalo: forma rettangolare, dimensioni: 8,3 µm x 4,5 µm Lunghezza media della struttura intermedia: 12,2 µm mentre la coda è di circa 54,8 µm (Saeed et al., 1989) Lunghezza totale dello spermatozoo di bufalo: maggiore di quella del bovino (75,4 vs. 69,3 µm )

Spermatozoi di bufalo

Il seme è normalmente raccolto con una convenzionale vagina (VA) artificiale per bovini; La temperatura dell’acqua posta nell’intercapedine della VA deve essere di circa 40-42°C, la pressione deve essere variata per far adattare al meglio la VA ai differenti tori; La concentrazione spermatica è aumentata da 2-3 false monte prima della reale raccolta;

Un eiaculato normale raccolto per mezzo di una VA è cremoso e di colore bianco, simile al latte; Il volume in media è di 6ml, eccezionalmente si trovano tori che forniscono 11 ml per monta; La concentrazione spermatica è compresa tra 1 e 4 x 109 cellule/ml

Inseminazione artificiale

L’inseminazione artificiale (IA) viene utilizzata da circa 40 anni nel continente Indo-Pakistano, ma con risultati inferiori rispetto al mono bovino a causa della difficoltà dell’identificazione dell’estro; Un altro fattore che non ha facilitato la diffusione della IA è il basso indice di fertilità ottenuto con il seme congelato o refrigerato.

Il seme di bufalo differisce da quello di bovino in alcune delle sue caratteristiche metaboliche e fisiologiche come per esempio nel contenuto di DNA-RNA, fosfolipidi ed enzimi. A causa di queste differenze i mestrui utilizzati per la conservazione del seme bovino sono inadatti allo stoccaggio di quello bufalino.

Timed insemination per mezzo della sincronizzazione dell’ovulazione nel bufalo

A causa delle esigue e a volte poco chiare manifestazioni estrali della razza bufalina, il riconoscimento del momento più opportuno per l'inseminazione artificiale risulta alquanto difficoltoso ed oneroso, in quanto prevedrebbe l'utilizzo di personale specializzato costantemente a contatto con gli animali.

Per ovviare a questo problema numerosi sono stati gli studi per l'individuazione di un protocollo che permettesse di standardizzare i tempi di intervento nella F.A.

Utilizzo di Prostaglandine e GnRH Le prostaglandine sono spesso usate per sincronizzare le manifestazioni estrali e come supporto di altre biotecnologie. La prostaglandina induce la regressione del corpo luteo e conseguentemente un calo nei livelli plasmatici di progesterone. Alle successive manifestazioni estrali segue quindi l'ovulazione a distanza di 2 - 5 gg. dalla somministrazione ormonale (Nebel and Jobst, 1998).

Tale intervallo di tempo dipenderà dal giorno del ciclo estrale in cui interverremo a causa della variabilità nella popolazione follicolare al momento della regressione del corpo luteo (Kastelic e Mapletoft, 1998). Dunque un protocollo che usi un momento prefissato di inseminazione e l'utilizzo di sola prostaglandina non può avere successo.

Per ridurre tale variabilità alcuni ricercatori hanno studiato l'uso del GnRH seguito dalla somministrazione di prostaglandina dopo 7gg. Nel 60-70% degli animali trattati è comparso l'estro nei 4 giorni successivi alla somministrazione della prostaglandina. (Twagiramungu et al., 1995).

Altri studi hanno dimostrato l’efficacia maggiore di una seconda somministrazione di GnRH 36-48h dopo la somministrazione di prostaglandina. Questo accorgimento migliora l'efficienza dell'inseminazione artificiale effettuata a 16-24 ore dopo la somministrazione dell'ormone poiché sincronizza l'ovulazione in un breve periodo di tempo (32.0 ± 5.7 h). Su 33 animali testati 23 (70%) hanno ovulato nell’arco di 12 ore.

Protocollo OVSYNC e inseminazione a tempo programmato CONDIZIONAMENTO ORMONALE DEI BUFALI GnRH PgF2a GnRH 1^ I.A. 2^ I.A. 0 7 9 10 11 giorni Protocollo OVSYNC e inseminazione a tempo programmato

Utilizzo del Progesterone e progestinici Nel bufalo ci sono pochi lavori scientifici sull'uso del progesterone e/o progestinici per la sincronizzazione degli estri e dell'ovulazione al fine di attuare la fecondazione artificiale. In Italia ed all’estero, si sono ottenuti risultati differenti, con l’applicazione di diversi progestinici seguita, alla rimozione, da somministrazione di prostaglandine e doppia fecondazione in terza e quarta o quinta giornata. (Rajamahendran and Thamotharam , 1983; Rao e Rao, 1983; Bodhipaksha et al., 1984; Zicarelli et al., 1997)

Protocollo CIDR-e ed inseminazioni a tempo programmato CONDIZIONAMENTO ORMONALE DEI BUFALI Estrazione Inserimento CIDR-e + CIDR-e PgF2 1^I.A 2˄I.A 0 12 14 15 g i o r n i Protocollo CIDR-e ed inseminazioni a tempo programmato

CONDIZIONAMENTO ORMONALE DEI BUFALI Estrazione Inserimento PRID + PRID PgF2 1^ I.A. 2^ I.A. 0 12 14 15 giorni Protocollo PRID e inseminazione a tempo programmato

PROTOCOLLI DI SINCRONIZZAZIONE CONDIZIONAMENTO ORMONALE DEI BUFALI PROTOCOLLI DI SINCRONIZZAZIONE BUFALE N. GRAVIDE N. (%) VUOTE A: OVSYNCH 19 9 (47,4) 10 (52,6) B: PRID 18 6 (33,3)a 12 (66,7) C: CIDR-e 20 12 (60,0)b 8 (40,0) TOTALE 57 27 (47,4) 30 (52,6)

Risultati ottenuti in bufale sottoposte a tre differenti protocolli di sincronizzazione degli estri.

b a ab Percentuali di concepimento in bufale sottoposte a tre differenti protocolli di sincronizzazione degli estri (a≠b per p<0,05).

Comportamento riproduttivo e dinamica follicolare durante il trattamento superovulatorio

Indaginoso riconoscimento Induzione della superovulazione nel bufalo: pochi cambiamenti rispetto al passato. Embryo transfer nei bufali: Difficoltà per Individuazione giorno preciso ovulazione (Misra, 1993; Drost, 1996; Baruselli, 1997). Schemi di inseminazione con tasso di fertilità inadeguato Dubbio rilevamento estri Indaginoso riconoscimento strutture ovariche

Lo scopo della superovulazione e dell’embryo transfer è quello di ottenere il più grande numero di embrioni sfruttando al massimo il potenziale di gravidanze. (Bo et al., 1996). Il monitoraggio delle strutture ovariche per mezzo ecografico ci evidenzia la risposta follicolare al trattamento superovulatorio (Pierson; Ginther, 1987c; Mapletoft et al., 1994).

Ci sono scarse informazioni sulla follicologenesi bufalina e altre modificazioni intraovariche durante la superovulazione . A causa principalmente del rapido sviluppo dell’embrione di bufalo il ricovero dell’embrione andrebbe fatto il giorno 5 o 6 del ciclo estrale quando le dimensioni del CL sono ancora piccole ed appare relativamente soffice. (Singla et al., 1996).

Dopo il trattamento superovulatorio, il bufalo mostra : una buona risposta follicolare, una media percentuale ovulatoria e formazione di CL MA, AL CONTRARIO, UN BASSO EMBRYO RECOVERY RATE. Il bufalo mostra uno sviluppo di un pool follicolare che raggiunge 0.8 cm di diametro durante l’estro superovulatorio, ciò dimostra che la bassa efficienza di embryo transference in questa specie non può essere correlata alla risposta follicolare. (Baruselli et al., 1997 e Baruselli et al., 1998).

Inoltre, il 48.9 % dei bufali superovulati non produce embrioni, e la produzione di embrioni per flushing dei rimanenti animali varia enormemente (1-11) La reale causa di questo bassao embryo recovery rate è tuttora sconosciuta.

Per spiegare la bassa embryo recovery rate riscontrata nel bufalo sono stati condotti alcuni lavori (Baruselli et al., 2000) correlando l’esame ecografico all’ispezione diretta delle ovaie dopo macellazione degli animali.

Lo scopo di questi lavori è stato quello di capire se il basso embryo recovery rate nelle bufale superovulate è dovuta al fallimento della crescita follicolare, dell’ovulazione o dell’ingresso dell’oocita nell’ovidotto.

Dunque: Sembra che un’alta percentuale di oociti fallisca l’ingresso nell’ovidotto dopo la superstimolazione della crescita follicolare I risultati forniscono una grossa evidenza al fatto che il basso embryo recovery rate sia spiegabile in questo modo.

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