Coltura in vitro dell’embrione pre-impianto Scuola di Specializzazione in Fisiopatologia della Riproduzione (A.A. 2016/17) Coltura in vitro dell’embrione pre-impianto Corso di Biotecnologie della Riproduzione Animale Prof.ssa M.E. Dell’Aquila

Sommario (1) Aspetti storici Lo sviluppo embrionale nell’ovidutto La coltura dell’embrione in vivo Metabolismo dell’embrione precoce e blocco dello sviluppo (test metabolici) Sistemi di coltura in vitro Medium chimicamente definiti e semi-definiti

Sommario (2) La co-coltura (cellule epiteliali oviduttali, cumulo ooforo, granulosa, cellule uterine, vescicole trofoblastiche, Vero cells, BRL=Buffalo rat liver cells) I terreni di coltura pre-condizionati Ormoni, fattori di crescita, citochine nella coltura embrionale in vitro La valutazione morfologica dell’embrione (Criteri delle società scientifiche internazionali)

Aspetti storici Sreenan, 1968; Sreenan e Scanlon, 1968 Adams, 1968 (primi reports di una procedura di coltura in vitro dell’embrione precoce bovino fino allo stadio di blastocisti) Adams, 1968 (primo report di una procedura di coltura in vivo dell’embrione precoce bovino in ovidutti di coniglia fino allo stadio di hatching blastocyst) Gandolfi, 1986; Gandolfi e Moor, 1987 (primi reports di una procedura di coltura in vitro dell’embrione precoce bovino fino allo stadio di blastocisti su monostrato di cellule epiteliali oviduttali) Avvio studi interazioni biochimiche ovidutti-embrione

Sviluppo dell’embrione pre-impianto Il microambiente oviduttale Divisioni embrionali e compattazione dell’embrione Trasformazione della morula in blastocisti Mortalità embrionaria

Lo sviluppo dell’embrione nell’ovidutto Immagine percorso in ovidutto

Stadi di sviluppo dell’embrione bovino

Stadi di sviluppo dell’embrioneumano

Stadi di sviluppo dell’embrione umano 2PB 2PN 4 cellule 8 cellule morula blastocisti

L’Hatching

L’impianto dell’embrione alla parete uterina

Arrivo in cavità uterina e impianto nelle diverse specie Arrivo (giorni) Impianto (giorni) Bovina 3-4 12 Cagna 5-8 13-17 Gatta Pecora 3 15 Cavalla 5-6 25-30 Scrofa 2 Umana 4

Cause di mortalità embrionaria nei ruminanti domestici Diagramma cause di mortalità embrionaria

Metabolismo dell’embrione precoce e blocco dello sviluppo Attivazione del genoma embrionale

Attivazione del genoma embrionale L’attivazione del genoma embrionale inizia in fasi diverse nelle varie specie: Topo, Capra, Criceto: 2 cellule Bovini, Ovini: 8-16 cellule Suini: 4 cellule Uomo: 4-8 cellule

Esiste una gerarchia di geni regolatori dello sviluppo embrionale: Differenziamento Esiste una gerarchia di geni regolatori dello sviluppo embrionale: Geni ad effetto materno (si esprimono nelle fasi comprese tra la maturazione e le prime divisioni embrionali) Geni gap (funzioni del nucleo, elementi del citoscheletro, canali di membrana, trasportatori di ioni, proteine di superficie o secrete, fattori di crescita e loro recettori) Geni per la segmentazione e polarità dell’embrione (geni che controllano il pattern di formazione dell’asse antero-posteriore dell’embrione) Geni omeotici (specificazione dei segmenti, contengono homeo-box) Geni tessuto-specifici

Sistemi di coltura in vivo Ovidutto di coniglia Ovidutto di pecora Ovidutto di bovina Sistema di coltura in ovidutti isolati Sistema di coltura in embrioni di pollo

Sistemi di coltura in vitro Uso di terreni di coltura convenzionali Fattori importanti (fase gassosa, luce, temperatura, controllo qualità terreno, tossicità del O2 Supplementazione con siero Uso di sostituti del siero (BSA, PVP, PVA..) Formulazioni del SOF (synthetic oviductal fluid) Uso di terreni chimicamente definiti Uso di terreni pre-condizionati

La co-coltura con cellule oviduttali Flushing degli ovidutti Trasporto degli ovidutti Problemi coltura cellule oviduttali: - frequenti contaminazioni - rapido dedifferenziamento

Il setting-up del monostrato di cellule oviduttali 1. Il flushing degli ovidutti

Il setting-up del monostrato di cellule oviduttali Nel giorno dell’ IVM allestire piastre Petri da 30 mm contenenti microgocce da 25 ml di terreno di coltura embrionale ricoperte di paraffina liquida Aggiungere cellule oviduttali Cambio di terreno ogni 48h (50%)

La cocoltura con cellule non oviduttali Vantaggi e svantaggi Monostrati di cellule del cumulo ooforo o granulosa Uso di cellule in sequenze particolari Coltura con vescicole trofoblastiche

Uso dei terreni precondizionati Terreni precondizionati attraverso breve esposizione a cellule oviduttali/uterine o a cellule di granulosa/cumulo ooforo o a vescicole trofoblastiche

Ormoni, fattori di crescita e citochine nella coltura embrionale Insulina EGF, IGF-I, IGF-II, TGF, PDGF LIF, Interleukin 6

Metodi per la valutazione della qualità embrionaria Analisi morfologica e morfometrica Età dell’embrione e stadio di sviluppo Conta del numero di blastomeri e nuclei Hatching

Valutazione morfologica Blastomeri regolari/assenza frammenti Blastomeri reg-irreg/molti frammenti Blastomeri regolari/alcuni frammenti Pochi blastomeri/severa frammentazione Blastomeri irregolari

Test metabolici (valutazione vitalità embrionaria) LDH Uptake di Glucosio, Glutamina, Piruvato

Letture consigliate “Culturing and evaluating the early embryo” in: Gordon I. Laboratory production of cattle embryo. CABI publications Chap 7 2003.