La replicazione del DNA in Eucarioti

Analogie e Differenze nella replicazione del DNA in Eucarioti e Procarioti I meccanismi della replicazione del DNA sono abbastanza simili in eucarioti e procarioti. La replicazione del DNA è semiconservativa ed è continua su un filamento e discontinua sull’altro. Come nei procarioti, la replicazione negli eucarioti richiede la sintesi di corti primer di RNA, l’allungamento dei primer da parte della DNA polimerasi e (sul filamento discontinuo) l’unione dei frammenti di Okazaki. Una differenza significativa tra la replicazione del DNA in procarioti e eucarioti è la dimensione più piccola dei frammenti di Okazaki nelle cellule eucariotiche (–lunghi circa 135 basi,) o pari alla lunghezza del DNA avvolto su un nucleosoma.

Assemblaggio dei nucleosomi Analogie e Differenze nella replicazione del DNA in Eucarioti e Procarioti Negli eucarioti, il macchinario della replicazione deve procedere attraverso la struttura complessa della cromatina, che deve essere disassemblata e poi ricostruita sulle molecole di DNA figlie man mano che il macchinario di replicazione procede. Non solo deve essere copiato fedelmente il DNA, ma deve essere anche rigenerata la struttura della cromatina altamente organizzata. Assemblaggio dei nucleosomi

ASSEMBLAGGIO DEL NUCLEOSOMA L’assemblaggio del nucleosoma consiste nella associazione ordinata dei complessi proteici istonici con il DNA. Inizia con la formazione del tetramero 2xH4+2xH3 Il tetramero si lega al DNA ds tetramero + DNA ds reclutano due dimeri di H2A+H2B

La ridistribuzione degli Istoni dopo la replicazione del DNA Metà dei nucleosomi deposti sui cromosomi fratelli devono essere di nuova sintesi. L’altra metà sarà costituita da vecchi istoni riutilizzati o da quelli di nuova sintesi??? I vecchi istoni sono sono presenti in entrambi i cromosomi figli con una distribuzione parzialmente casuale Il tetramero H3-H4 rimane legato casualmente ad uno dei due filamenti neosintetizzati mentre i dimeri H2A-H2B vengono rilasciati nel pool solubile e si mescolano con quelli di neosintesi Watson pag 172

Le modifiche della coda Le modifiche formano un codice che è letto dalle proteine coinvolte nell’espressione genica o in altre reazioni che riguardano il DNA Acetilazione delle Lisine Eliminazione di cariche positive = minore affinità x il DNA l’aggiunta del gruppo acetile fa perdere la carica positiva all’estremita’ NH3 delle lisine e come conseguenza fa perdere affinita’ agli istoni x il DNA Nucleosomi acetilati = DNA trascrizionalmente attivo Deacetilazione delle Lisine Ripristino di cariche positive = ripristino di affinità x il DNA Fosforilazione delle serine Aumento di cariche negative = perdita di affinità x il DNA Defosforilazine delle serine Diminuzione di cariche negative = ripristino di affinità x il DNA Watson pag 168 l’aggiunta del gruppo acetile (C = O ---CH3) fa perdere la carica positiva all’estremita’ NH3 delle lisine e come conseguenza fa perdere affinita’ agli istoni x il DNA

L’eredità dei tetrameri H3-H4 parentali facilita la trasmissione dello stato della cromatina Sui cromosomi fratelli vi è la stessa distribuzioni delle modificazioni che erano presenti sui cromosomi parentali Le modificazioni stesse reclutano gli enzimi modificanti Gli enzimi modificanti agiscono sugli istoni adiacenti RISULTATO corretta propagazione dello stesso stato di modificazione sui due cromosomi di neosintesi aaa L’acetil trasferasi si lega alle code acetilate degli istoni parentali e modifica gli istoni adiacenti Watson pag 173

I trasportatori degli ISTONI

Ogni cromosoma eucariotico contiene molti repliconi. 真核复制子与原核位置的对比见于表14.1，独立的真核复制子相对较小。它们复制的速率比微生物复制叉运动速率要慢的多。 我们很想知道是什么促成每次复制的开始，是否是一个特殊的DNA序列，其长度如何，不同的起点之间的顺序如何?是否一个起点与一个在染色体内的高度有顺序的结构的特定形态有关。 在图14.1中所指出的复制速率中，显示出，在所有复制功能都激的情况下，一个乳腺细胞的基因在1小时之内复制完。但在典型的体细胞中，S期确要持续6个小时以上。这说明：不超过15%的复制过程在任何给定的情况下活动，(有一些特例，如早期Drosophila胚胎的胚胎细胞的分裂当中，S期的长度被大量复制的刺激功效压缩了)。 在S期的不同时间内，要开始复制的起点如何选定?是不是在起点序列中包含着使用时间的信息?有一个有趣的问题：即复制机制中如何将已复制过的起点和未被复制的起点分别开来，是否每个起点在S期都能一次且仅一次的应用，与它有关的是蛋白质或DNA的成分(例如：看其甲基化的成分)。 已用的根据表明，染色体复制不是因为复制叉停止运动或从DNA上脱落下来而停止。更有可能的是，一个复制叉直到它碰到一个相邻复制的复制叉时才停下来，我们曾经指出：在复制叉的连接处加入一段合成DNA的逻辑可能性的问题。

LE DNA POLIMERASI EUCARIOTICHE α = ATTIVITA’ PRIMASICA δ e ε = ATTIVITA’ POLIMERASICA Le cellule eucariotiche contengono 5 DNA polimerasi. Tre (le polimerasi α ,  e  ) sono utilizzate durante la fase S della replicazione. Come nei procarioti, il complesso della replicazione contiene anche altre proteine, tra cui elicasi e varie proteine accessorie chiamate fattori di replicazione.

Origini della replicazione Negli eucarioti, la velocità di spostamento della forcella di replicazione è circa 10 volte minore di quella nei procarioti, probabilmente a causa della componente proteica della cromatina Origini della replicazione La bassa velocità di spostamento della forcella di replicazione e la grande dimensione dei genomi eucariotici, richiede che i cromosomi eucariotici abbiano più origini di replicazione; ce ne sono diverse centinaia per cromosoma. La replicazione procede bidirezionalmente a partire da queste origini. La presenza di più replicatori è una forma di ridondanza che permette di assicurare la completa replicazione di ciascun cromosoma

Ciclo cellulare

Nella fase S il complesso pre-RC viene attivato FORMAZIONE E ATTIVAZIONE DEL COMPLESSO PRE-RC NEGLI EUCARIOTI……….. Negli eucarioti si forma un complesso pre-replicativo (pre-RC) in fase G1 Processo ordinato: Associazione del complesso di riconoscimento del replicatore (ORC) Reclutamento di almeno 2 proteine addizionali (Cdc6 e Cdt1) Reclutamento della putativa elicasi (complesso Mcm2-7) Nella fase S il complesso pre-RC viene attivato

La cellula entra in fase S FORMAZIONE E ATTIVAZIONE DEL COMPLESSO PRE-RC NEGLI EUCARIOTI il complesso pre-RC viene attivato da due chinasi (Cdk e Ddk) La fosforilazione ad opera di Cdk e Ddk di proteine del complesso pre-RC avvia il processo di replicazione. il complesso Mcm (elicasi like) è fosforilato e recluta le polimerasi ε e δ c) La polimerasi  / primasi viene reclutata e sintetizza un RNA innesco e lo allunga x un poco a b c

e) le polimerasi ε e δ riconoscono l’innesco e cominciano la sintesi FORMAZIONE E ATTIVAZIONE DEL COMPLESSO PRE-RC NEGLI EUCARIOTI d e d) Il complesso innesco–stampo viene riconosciuto dalla proteina che posiziona la sliding clamp che quindi viene assemblata su questo sito e) le polimerasi ε e δ riconoscono l’innesco e cominciano la sintesi La reazione continua………….

TUTTO E’ REGOLATO A LIVELLO DEL CICLO CELLULARE CONTROLLO DELLA REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI E’ fondamentale che il DNA cromosomico venga replicato completamente e una e una sola volta, per ogni divisione cellulare. Questo può essere problematico per i cromosomi eucariotici, dato che contengono migliaia origini di replicazione. Bassi livelli di Cdk inducono la formazione del complesso Pre-RC ma non sono sufficienti x far partire la reazione Alti livelli di Cdk Effetto contrario TUTTO E’ REGOLATO A LIVELLO DEL CICLO CELLULARE

CONTROLLO DELLA REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI L’attività di Cdk e la formazione del complesso Pre-RC sono regolati nel ciclo cellulare FASE G1 I livelli di Cdk sono bassi I complessi Pre-RC possono essere formati ma non possono essere attivati FASE S I livelli di Cdk sono alti I complessi Pre-RC sono attivati ma non possono essere assemblati sui filamenti di neosintesi UNA VOLTA CHE UN Pre-RC E’ STATO USATO DEVE ESSERE DISASSEMBLATO

Rimozione del primo innesco a RNA Il meccanismo di sintesi di un DNA lineare non è capace di copiare le estremità dei cromosomi lineari L’estremità 3’ di un filamento di DNA circolare può innescare la sintesi del DNA per riempire lo spazio vuoto lasciato dal primo innesco

La rimozione del primo innesco in un cromosoma lineare porterebbe alla perdita di informazione. La DNA polimerasi infatti, non è in grado di replicare il cromosoma fino alla sua terminazione Le interruzioni diverrebbero sempre più lunghe ogni volta che il DNA si replica Risoluzione del problema ad opera della TELOMERASI che aggiunge ripetizioni in tandem di sequenze nucleotidiche TELOMERI

I Telomeri I telomeri sono delle strutture formate da DNA e proteine presenti alle estremità dei cromosomi lineari costituiti da ripetizioni in tandem di una specifica sequenza

I Telomeri Il telomero non codifica per alcun prodotto proteico. Le cellule eucariotiche completano la sintesi del filamento lagging dei cromosomi lineari attraverso l’addizione di telomeri all’estremità di ogni cromosoma Il telomero non codifica per alcun prodotto proteico. Ha un ruolo determinante nell'evitare la perdita di informazioni durante la duplicazione dei cromosomi. che vengono accorciati ad ogni replicazione SE NON CI FOSSERO I TELOMERI LA REPLICAZIONE DEL DNA COMPORTEREBBE UNA SIGNIFICATIVA PERDITA DI INFORMAZIONE GENETICA. La sequenza esatta delle ripetizioni telomeriche è specie-specifica

Le Telomerasi Unità ripetitive di sequenze telomeriche sono addizionate all’estremità dei cromosomi da parte di enzimi chiamati telomerasi RIBONUCLEOPROTEINA La Telomerasi deve addizionare nucleotidi senza l’utilizzo di un DNA primer. Per questo motivo, ogni Telomerasi contiene un breve RNA complementare alla sequenza telomerica che deve essere sintetizzata.

La Telomerasi TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) Consiste di due componenti principali: TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) subunità con attività di trascrittasi inversa conosciuta come trascrittasi inversa telomerasica TERC (Telomerase RNA Component) molecola di RNA conosciuta come il componente ad RNA della telomerasi che serve da copia per la sintesi di nuove ripetizioni telomeriche.

La telomerasi trasloca alla nuova estremità 3’ del telomero Estensione del DNA telomerico da parte della telomerasi IBRIDAZIONE La componente ad RNA della telomerasi complementa con l’estremità 3’ del filamento di DNA telomerico ESTENSIONE Sfrutta i nucleotidi del suo RNA non complementati al telomero come stampo per l’aggiunta di 3 nucleotidi (TTG) TRASLOCAZIONE La telomerasi trasloca alla nuova estremità 3’ del telomero La telomerasi aggiunge nucleotidi utilizzando come stampo il suo RNA

Riempimento del filamento esteso SINTESI DELL’INNESCO Quando la telomerasi ha aggiunto un elevato numero di ripetizioni la PRIMASI sintetizza inneschi a RNA REPLICAZIONE DEL DNA La DNA polimerasi copia il secondo filamento del telomero a partire dall’innesco formato dalla Primasi RIMOZIONE DELL’INNESCO L’ innesco viene rimosso, lasciando 12-16 nucleotidi che estrudono dal telomero neo-sintetizzato IL CICLO CONTINUA

questo meccanismo lascia sempre un’estremità a singolo filamento che probabilmente si organizza in una struttura compatibile con la proteizione delle estremità dei cromosomi. RUOLI DEL TELOMERO Stabilizzano le estremità cromosomiche lineari formando, quello che viene definito, un “cappuccio protettivo” che impedisce i riarrangiamenti intra- ed intercromosomici Ansa telomerica

cromosomi senza telomeri sono appiccicosi RUOLI DEL TELOMERO cromosomi senza telomeri sono appiccicosi La presenza dei telomeri impedisce ai macchinari di riparo del DNA di riconoscere le estremità cromosomali come rotture dei cromosomi stessi e di riparare il danno congiungendoli tra loro In assenza di telomeri la cellula rivelerebbe una falsa lesione, si innescherebbe il checkpoint che blocca la divisione cellulare e le cellule morirebbero Checkpoint = segnale che rivela alla cellula una lesione del DNA, la cellula blocca la divisione cellulare fini a che il danno non è riparato cromosomi senza telomeri bloccano la divisione cellulare

STRUTTURA DEL TELOMERO Sono caratterizzati da un filamento 3'-protrudente che si ripiega all’indietro ed invade la regione a doppia elica dei telomeri formando quello che viene chiamato T-loop. t-loop (T-loop) protegge le estremita cromosomiche da nucleasi e da attività cellulari che possono essere dannose per la sua integrità, come dall’attacco di proteine coinvolte nella riparazione.

Stabilità cromosomica = stabilità telomerica CROMOSOMI SENZA TELOMERI VENGONO DEGRADATI In ogni specie la lunghezza dei telomeri e’ mantenuta entro un determinato intervallo di lunghezza quindi esiste un omeostasi tra perdita e acquisto di unita’ ripetute ai telomeri Stabilità cromosomica = stabilità telomerica

TELOMERI E SENESCENZA I telomeri di individui anziani sono piu’corti dei telomeri dei gameti cosi come nelle malattie ad invecchiamento precoce gli individui mostrano telomeri corti. Di conseguenza, cellule normali in coltura presentano una vita breve e vanno incontro ad un arresto della crescita, detto SENESCENZA. In cellule in coltura, con l’insorgenza della senescenza, le telomerasi sono meno attive e i cromosomi si accorciano Nei tessuti normali di un adulto, l’attività della telomerasi e l’espressione dell’ mRNA di TERT sono ridotte.

TELOMERASI E SENESCENZA Le telomerasi sono molto attive durante lo sviluppo embrionale, in cellule staminali o in riproduzione, ma non nella maggior parte dei tessuti adulti Le cellule somatiche differenziate non hanno telomerasi e vanno incontro a senescenza duplicativa che e’ associata con un diminuzione della lunghezza dei telomeri. Le cellule in coltura possono essere “immortalizate” attraverso l’introduzione di geni codificanti telomerasi.

Le cellule tumorali hanno vita indefinita e le telomerasi sono attive TELOMERASI E TUMORE In studi effettuati su diversi tipi di tumore l’espressione del gene TERT e l’attività della telomerasi è spiccata Il 90% dei tumori presentano attivazione della telomerasi Le cellule tumorali hanno vita indefinita e le telomerasi sono attive o iperattive (causa o effetto?) Lo sblocco della telomerasi non è sufficiente, ma sembra essere necessaria per lo sviluppo e la proliferazione del tumore Le cellule cancerose sono caratterizzate dalla capacità di riattivare la telomerasi, e ciò consente a esse di riprodursi indefinitamente, e di raggiungere una sorta di "immortalità".

TELOMERASI E TUMORE La sua riattivazione in qualche passaggio dello sviluppo tumorale previene l’accorciamento critico dei telomeri e quindi l’arresto proliferativo in più del 90% dei tumori nell’uomo, Il risultato apre le porte alla progettazione di farmaci antitumorali di nuova concezione e, in prospettiva, anche a terapie contro l'invecchiamento "La telomerasi infatti è un obiettivo ideale per la chemioterapia, dato che è attiva in quasi tutti i tumori umani ma è inattiva nella maggioranza delle cellule normali" Ciò significa che un farmaco che disattivi la telomerasi agirebbe contro tutti i cancri, ma con scarsi effetti collaterali."

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