Elettroforesi Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine, Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico
Principio: Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico. Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA. Forza elettrica : Fel = q · E Forza frizionale : Ffr = f ·v (f = 6 r ) Quando le forze si bilanciano: q ·E = f ·v q v = — · E f v q mobilità elettroforetica : = — = — E f
Applicando un campo elettrico si può avere effetto Joule: V = R I W = R I2 Operare a I costante Dissipare l’eccesso di calore
Acidi nucleici
ELETTROFORESI SU SUPPORTO su carta su gel
Formazione di un gel di poliacrilammide CH2
Acrilamide, bisacrilamide monomeri Ione perossodisolfato iniziatore TEMED catalizzatore L’ossigeno è un radicale, quindi interferisce con la polimerizzazione
Effetto “setaccio” in un gel uniforme
MOBILITA’ ELETTROFORETICA ED EFFETTO “SETACCIO MOLECOLARE” Se q L, in assenza di gel e’ pressoché indipendente dalle dimensioni molecolari
Visualizzazione del DNA: etidio bromuro luce UV
(Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) SDS-PAGE (Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare
Colorazione con Coomassie Colorazione con nitrato di Ag Si possono effettuare valutazioni quantitative delle bande proteiche col densitometro: misurazione della luce trasmessa quando un raggio luminoso è fatto passare attraverso il gel colorato. Si hanno picchi di assorbimento di cui si può calcolare l’area che è proporzionale alla quantità di proteina
Applicazioni della SDS-PAGE Purezza del campione Determinazione del PM Western blot Purificazione della proteina
Applicazioni dell’SDS-PAGE Determinazione del PM
Elettroforesi delle proteine plasmatiche