CROMATOGRAFIA Michail Semenovich Tswett (1872-1919), botanico russo, studioso dei pigmenti vegetali Fase 1: il campione viene “caricato” in testa alla colonna Fase 2: il campione viene “eluito” nella colonna finché i componenti escono separati Esperimento fondamentale

Unendo le frazioni 8-10 si ottiene il componente A “puro”. Unendo le frazioni 16-19 si ottiene il componente B “puro”. Unendo le frazioni 21-25 si ottiene il componente C “puro”.

CROMATOGRAFIA Definizioni La cromatografia è una tecnica che permette di separare ed analizzare (sia per scopi qualitativi che quantitativi) miscele incognite liquide o gassose. Tutte le tecniche cromatografiche sono caratterizzate dalla presenza di una fase mobile che spinge gli analiti “in avanti” nel mezzo cromatografico, a velocità costante, e da una fase stazionaria che li rallenta in modo selettivo. Le due fasi devono essere tra loro immiscibili: la fase stazionaria può essere solida o liquida mentre la fase mobile può essere liquida o gassosa. La separazione dei componenti della miscela avviene a causa della diversa affinità che gli analiti hanno per le due fasi.

Classificazione delle tecniche cromatografiche Stato fisico delle due fasi cromatografia liquida gascromatografia 2. Meccanismo di ritenzione - adsorbimento ripartizione scambio ionico esclusione affinità 3. Apparato strumentale - cromatografia su colonna cromatografia su strato sottile

Meccanismi di ritenzione

Adsorbimento La fase stazionaria è un solido.

Ripartizione La fase stazionaria è un liquido che ricopre un supporto solido.

Scambio ionico La fase stazionaria è un solido che presenta in superficie gruppi che portano una carica elettrostatica, positiva o negativa.

Scambio ionico Gli ioni del soluto competono con quelli della fase mobile per legarsi ai gruppi di carica opposta presenti sulla fase stazionaria.

Esclusione sterica La fase stazionaria è un solido o un gel che presenta dei pori di dimensioni note ed opportune.

Esclusione sterica Le molecole più grosse non possono entrare nei pori e vengono “eluite” prima di quelle più piccole.

Affinità La fase stazionaria è un solido derivatizzato in superficie con “recettori” in grado di legare solo la molecola in esame.

Il cromatogramma Il cromatogramma è il grafico del segnale fornito dal rivelatore in funzione del tempo di analisi. Il tempo zero è l’istante dell’iniezione del campione in colonna. Il cromatogramma è composto dalla linea di base (cioè il segnale della fase mobile in assenza di campione) e dai picchi cromatografici dovuti agli analiti che escono dalla colonna. t0

Parametri cromatografici Ritenzione: è la capacità del sistema cromatografico di trattenere gli analiti presenti nel campione. Si ricava dalla posizione dei picchi nel cromatogramma. Selettività: è la capacità del sistema cromatografico di separare due analiti presenti nel campione. Si ricava dalla distanza dei picchi corrispondenti ai due analiti, nel cromatogramma. Efficienza: è la capacità del sistema cromatografico di eluire gli analiti come bande compatte (strette). Si ricava dalla larghezza dei picchi nel cromatogramma.

Ritenzione tR = tempo di ritenzione: tempo trascorso dall’iniezione del campione all’uscita del picco. t0 = tempo morto: tempo trascorso dall’iniezione del campione all’uscita del solvente o di un soluto non trattenuto dalla fase stazionaria. È una misura del volume vuoto in colonna. k’ = fattore di capacità = (tR – t0) / t0. t0

Ritenzione in TLC Fattore di ritenzione: RF = di / del

a = k’B / k’A Selettività È la capacità del sistema cromatografico di separare due analiti presenti nel campione. In GC ed HPLC si misura per mezzo del coefficiente di selettività a, definito come il rapporto dei relativi fattori di capacità: a = k’B / k’A Il coefficiente di selettività è una grandezza adimensionale ed è sempre maggiore o uguale a 1.

Efficienza È la capacità del sistema cromatografico di eluire gli analiti come bande strette. In GC e HPLC si può stimare misurando la larghezza dei picchi alla base (w) o a metà altezza (w½), la deviazione standard del picco assimilato ad una gaussiana. t0

Efficienza Poiché la larghezza dei picchi dipende anche dal tempo di ritenzione una stima migliore dell’efficienza si ha calcolando: N = 5.54 tR2 / w½2 N è adimensionale ed è detto: numero di piatti teorici. Volendo confrontare colonne di diversa lunghezza (L) si calcola l’altezza equivalente di piatto teorico (H, HETP), che ha le dimensioni di una lunghezza (cm): H = L /N

Durante la “corsa” cromatografica le bande si allargano Quali sono meccanismi che provocano questo allargamento?

A: Cammini multipli (se la colonna è impaccata)

B: Diffusione longitudinale

C: Trasferimento di massa

Equazione di van Deemter: I meccanismi di allargamento di banda (e quindi l’efficienza) dipendono dal flusso di fase mobile velocità di flusso, v Equazione di van Deemter: H = A + B/v + Cv

Risoluzione È la grandezza che misura l’effettiva bontà della separazione, che dipende sia dalla selettività che dall’efficienza del sistema. In GC ed in HPLC: Rs = DtR / ½ (wA + wB) dove DtR è la differenza dei tempi di ritenzione dei soluti A e B e wA, wB è la larghezza alla base dei picchi corrispondenti. Rs è adimensionale e i suo valore e maggiore o uguale a zero.

La risoluzione dipende dalla selettività…

… ma la risoluzione dipende anche dall’efficienza

Risoluzione in TLC Rs = d / ½ (wA + wB) dove d è la distanza tra i centri delle due macchie A e B e wA, wB il loro diametro.

Asimmetria Raramente i picchi cromatografici sono perfettamente simmetrici: normalmente presentano una “codatura” verso i bassi tempi di ritenzione (fronting) o verso gli alti tempi di ritenzione (tailing). L’asimmetria di un picco si misura attraverso il fattore di asimmetria: As = b / a dove a e b sono le semilarghezze del picco, misurate a 1/10 dell’altezza del picco.

I metodi cromatografici possono anche essere usati per scopi quantitativi: l’area del picco (e anche l’altezza se il picco è simmetrico) è infatti proporzionale alla concentrazione dell’analita. La concentrazione di un campione incognito si può ricavare per mezzo di diversi metodi di calibrazione. t0

Tecniche cromatografiche

Cromatografia su strato sottile TLC: Thin Layer Chromatography

TLC: deposizione dei campioni sulla lastra

TLC: sviluppo della lastra

TLC: rivelazione

Cromatografia liquida a bassa pressione

Cromatografia liquida a bassa pressione

Cromatografia liquida a bassa pressione Flash chromatography

GC: Gascromatografia Forno

GC: Gascromatografia

GC: Gascromatografia

Sistema di alimentazione del gas vettore

Iniettore per colonne impaccate Siringa per iniezione

Colonna impaccata per GC: 1-6 m x 0.75-4 mm ID

Colonna capillare per GC: 15-100 m x 0.1-0.75 mm ID

Caratteristiche dei materiali granulari IMPACCAMENTO Caratteristiche dei materiali granulari Le caratteristiche geometriche del materiale granulare che si usa come fase stazionaria solida o come supporto per la fase stazionaria liquida sono le seguenti: granulometria: distribuzione granulometrica; volume e diametro dei pori; area superficiale. La granulometria si misura spesso in “mesh” (maglie per pollice lineare); quella più usata per colonne impaccate è di 80-100 mesh (diametro delle particelle: 0.15 – 0.18 mm).

Principali fasi stazionarie per GLC Liquidi di ripartizione Proprietà: bassa tensione di vapore nelle condizioni di lavoro (0.01-0.1 mmHg), per minimizzare la perdita di liquido durante le analisi (bleeding), allungando la vita della colonna ed evitando interferenze nella risposta del rivelatore; elevata stabilità termica, per non decomporsi o modificarsi alle temperature di esercizio; elevata inerzia chimica verso i componenti della miscela, verso il supporto e anche verso il materiale di cui è costituita la colonna; buon effetto solvente sulla miscela, sia pure con una affinità diversa per ciascun componente, per favorirne la separazione; bassa viscosità alle temperature di esercizio, per diminuire la resistenza al trasferimento di massa dei soluti nella fase stazionaria e per migliorare così l’efficienza della colonna.

Principali fasi stazionarie per GLC Liquidi di ripartizione Classificazione In base alla loro natura chimica: idrocarburi, esteri e poliesteri, polieteri, ammidi e nitrili, poliglicoli, siliconi, fasi miste, fase chirali. In base alla polarità secondo gli indici di Kovats, Rohrshneider e Mc Reynolds. Le classi di polarità individuate sono: Prima classe: apolari (idrocarburi o siliconi con sostituenti non polari). Seconda classe: a bassa polarità (esteri di alcoli di grande massa molare o derivati siliconici (polisilossani) con sostituenti polari). Terza classe: polari (poliglicoli, polialcoli e i loro esteri). Quarta classe: molto polari (glicoli, glicerina, idrossiacidi).

Principali fasi stazionarie per GLC Fasi stazionarie legate Per limitare il fenomeno del bleeding quando la temperatura aumenta, la fase stazionaria può essere legata chimicamente al supporto. Deriva della linea di base causata dallo spurgo della fase stazionaria quando la temperatura della colonna aumenta.

Principali fasi stazionarie per GLC Fasi stazionarie ad azione mista Sono costituite da copolimeri reticolari porosi a base di etilvinilbenzene e dilvinilbenzene. Non hanno gruppi ossidrilici liberi e quindi consentono di minimizzare i fenomeni di tailing . La superficie delle particelle si comporta come se fosse sia un solido, che dà fenomeni di adsorbimento, sia un liquido, che dà fenomeni di ripartizione. Porapak: ha le proprietà di ripartizione tipiche delle superfici liquide di grande estensione, ma non richiede la disattivazione del supporto e non dà problemi di volatilità o viscosità eccessiva. Il tipo Q è il più usato per colonne tradizionali di circa 2 m con diametro esterno (OD) di 3 mm. Chromosorb serie 100 sono resine poliaromatiche copolimerizzate con molecole diverse, in modo da avere diversa porosità e polarità. Tenax GC, introdotti recentemente, sono polimeri a base di ossido di 2,6-difenil-p-fenilene. Possono essere usati fino a 375 °C e sono meno polari di Porapak e Chromosorb serie 100, per cui consentono di separare composti altobollenti (alcoli, ammine, glicoli polietilenici, e così via) in tempi brevi.

Esempio di profilo di temperatura a tre stadi (isoterma, rampa, isoterma) prima del ritorno alla temperatura iniziale per la nuova prova. La temperatura della colonna è uno dei parametri principali che governano la ritenzione. Il forno a circolazione d’aria calda deve permettere un accurato controllo della temperatura di esercizio (± 0.05 °C) in un ampio intervallo (da ambiente a 400 °C). Deve essere possibile variare la temperatura nel corso della prova (temperatura programmata) in modo rapido e preciso.

Effetto della temperatura sulla separazione di una miscela di idrocarburi alifatici lineari (da pentano a ottano, picchi 1-6), bromoformio (7), meta-clorotoluene (8) e meta-bromotoluene (9).

Indice di ritenzione secondo Kovats L’indice di ritenzione di Kovats è utilizzato in gascromatografia per convertire i tempi di ritenzione in costanti indipendenti dal sistema. L’indice di ritenzione di un composto chimico è il suo tempo di ritenzione normalizzato rispetto ai tempi di ritenzione dei due n-alcani adiacenti. Mentre i tempi di ritenzione dipendono dal sistema cromatografico (lunghezza della colonna, spessore del film, diametro, velocità del gas di trasporto e di pressione, tempo morto), gli indici di ritenzione sono del tutto indipendenti da questi parametri e consentono il confronto dei valori misurati in diversi laboratori, in condizioni variabili. Le tabelle degli indici di ritenzione possono aiutare ad identificare i componenti confrontando gli indici di ritenzione trovati sperimentalmente con valori noti. Indice di ritenzione secondo Kovats L’indice di ritenzione di un composto chimico è il suo tempo di ritenzione normalizzato rispetto ai tempi di ritenzione di due n-alcani adiacenti; non dipende da lunghezza della colonna, spessore del film, diametro, velocità o pressione del gas di trasporto e tempo morto e consente il confronto tra risultati ottenuti in diversi laboratori e in condizioni variabili.

I rivelatori universali sono dispositivi che consentono di individuare tutti i componenti di una miscela; i rivelatori selettivi, invece, consentono di individuare solo particolari categorie di composti. Il rivelatore è quel dispositivo che, posto all’uscita della colonna rileva una variazione di composizione della fase mobile (dovuta alla presenza degli analiti) e produce un segnale elettrico che viene raccolto e posto in grafico (cromatogramma) dal registratore, integratore o computer. I rivelatori più usati sono di tipo differenziale, ovvero forniscono una linea di base piatta quando dalla colonna esce solo il carrier, mentre danno un picco in corrispondenza di una banda di eluizione.

selettività; sensibilità; stabilità; tempo di risposta; rumore di fondo; deriva del segnale; limite di rivelabilità; intervallo di linearità. Le prestazioni di un rivelatore, o meglio di tutto il sistema, si valutano in base ai seguenti parametri:

La sensibilità del rivelatore verso un dato analita è la pendenza della corrispondente curva (retta) di calibrazione. selettività; sensibilità; stabilità; tempo di risposta; rumore di fondo; deriva del segnale; limite di rivelabilità; intervallo di linearità. Le prestazioni di un rivelatore, o meglio di tutto il sistema, si valutano in base ai seguenti parametri:

selettività; sensibilità; stabilità; tempo di risposta; rumore di fondo; deriva del segnale; limite di rivelabilità; intervallo di linearità. Le prestazioni di un rivelatore, o meglio di tutto il sistema, si valutano in base ai seguenti parametri:

selettività; sensibilità; stabilità; tempo di risposta; rumore di fondo; deriva del segnale; limite di rivelabilità; intervallo di linearità. Le prestazioni di un rivelatore, o meglio di tutto il sistema, si valutano in base ai seguenti parametri:

Composti verso i quali il FID ha sensibilità bassa o nulla Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) Composti verso i quali il FID ha sensibilità bassa o nulla

Accoppiamento GC-spettrometro di massa (GC-MS)

Accoppiamento GC-spettrometro di massa (GC-MS) Cromatogramma GC-MS di un acqua potabile (corrente ionica totale, TIC) Accoppiamento GC-spettrometro di massa (GC-MS) Spettro di massa dell’1-cloro-2-clorometil-benzene (PM = 161) Spettro di massa dell’esaclorobenzene (PM = 285)

Analisi del caffè per GC Condizioni sperimentali Colonna: SUPELCOWAX 10, 30m x 0.25mm ID, 0.25µm film Temperatura: da 40°C (5 min) a 230°C (4°C/min) Rivelatore: Spettrometro di massa a trappola ionica Iniezione: splitless/split (tempo di chiusura 0.5 min), 270°C (0.75mm ID liner)

Cromatografia liquida ad alte prestazioni HPLC: High Performance Liquid Chromatography

Cromatografia liquida ad alte prestazioni HPLC: High Performance Liquid Chromatography

HPLC: iniezione Siringa per HPLC (100 ml) Valvola a 6 vie (Rheodyne) Loop di iniezione

HPLC: colonna Colonna classica per HPLC (25 cm x 4.6 mm ID) a) particelle per LPC; b) particella pellicolare; c) microparticelle irregolari o sferiche Colonna classica per HPLC (25 cm x 4.6 mm ID)

HPLC: materiali di impaccamento a) particelle per LPC; b) particella pellicolare; c) microparticelle irregolari o sferiche 10 m 5 m Influenza della granulometria dell’impaccamento sulla risoluzione

Il gel di silice viene modificato con una reazione di sililazione HPLC: fasi legate Il gel di silice viene modificato con una reazione di sililazione + Cl-Si(CH3)2-(CH2)17-CH3  + HCl Struttura del gel di silice

HPLC: fasi legate silanoli Le fasi legate sono dette: “brush type” La derivatizzazione non è mai completa e sulla superficie dei grani di silice restano dei gruppi silanolici liberi. Questi gruppi silanolici possono dare forti interazioni polari secondarie con l’analita, causando grave asimmetria dei picchi. Le fasi legate sono dette: “brush type” Per evitare questi inconvenienti la fase stazionaria viene fatta reagire ulteriormente con trimetil-cloro-silano: Questa operazione viene detta “end-capping”. Cl-Si(CH3)3 silanoli

La fase stazionaria è più polare della fase mobile HPLC: “fase normale” Fasi stazionarie: silice, allumina o fasi legate Fasi mobili: solventi organici o loro miscele. Serie eluotropa su allumina secondo Snyder (all’aumentare di e° aumenta la “forza” del solvente)

La fase stazionaria è più polare della fase mobile HPLC: “fase normale” Escono prima i composti meno polari che sono poco trattenuti dalla fase stazionaria.

La fase stazionaria è meno polare della fase mobile HPLC: “fase inversa” La fase stazionaria è meno polare della fase mobile Fase stazionaria Fasi stazionarie comunemente impiegate in RP-HPLC Escono prima i composti più polari che sono poco trattenuti dalla fase stazionaria.

La fase stazionaria è meno polare della fase mobile HPLC: “fase inversa” La fase stazionaria è meno polare della fase mobile Solventi comunemente impiegati in RP-HPLC, classificati secondo la “solvent strength” (Snyder) Solvente S Acqua 0.0 Metanolo 3.0 Acetonitrile 3.1 Acetone 3.4 Diossano 3.5 Etanolo 3.6 Isopropanolo 4.2 Tetraidrofurano 4.4 Fase mobile In pratica, non si usano mai solventi puri, ma miscele acqua / modificatore organico. La percentuale dei due componenti dà la “forza del solvente”.

La fase stazionaria è meno polare della fase mobile HPLC: “fase inversa” La fase stazionaria è meno polare della fase mobile La ritenzione dipende dalla % di solvente organico: logk‘ = a·(%org) + b

Separazione di idrocarburi policiclici aromatici su RP-C18. Eluizione isocratica: MeOH/H2O 87.5% Eluizione in gradiente: MeOH/H2O da 62.5% a 100% a 6% al minuto Separazione di idrocarburi policiclici aromatici su RP-C18.

HPLC: rivelatori Rivelatore spettrofotometrico 1 1 Cella a flusso di tipo Z 1 Cella a flusso di tipo H

HPLC: rivelatori Rivelatore spettrofotometrico a serie di diodi (Diode Array Detector, DAD) Spettrocromatogramma HPLC di una miscela di 5 componenti. La presentazione tridimensionale è consentita dall’uso di un rivelatore UV/visibile in grado di acquisire immediatamente (in 60 ms) lo spettro durante l’uscita di un picco.

Analisi di erbicidi - HPLC Condizioni sperimentali: Colonna: 20cm x 3mm ID, diametro particelle 5µm; silice ricoperta con polimero Fase Mobile : gradiente, A = acqua/0.05% H3PO4, B = acetonitrile Temperatura: 50°C Velocità di flusso: 0.5mL/min Rivelatore: UV a serie di diodi, 210nm & 225nm Iniezione: 10µL of estratto

Determinazione di metalli di transizione nel siero - Cromatografia Ionica

Considerazioni conclusive La cromatografia è una classe di tecniche molto versatili. Infatti: è applicabile a tutti i tipi di campione (eventualmente con un opportuno pretrattamento); permette di compiere l’analisi senza una precedente separazione e/o purificazione; è utile sia per l’analisi qualitativa che quantitativa; può essere impiegata a scopo preparativo.