Espressione Genica Informazione contenuta nei geni (DNA) viene decodificata prima in RNA (Trascrizione) e successivamente in proteine (Traduzione)

Nucleotidi e Ribonucleotidi

L’RNA è costituituito da un singolo filamento ripiegato in strutture specifiche

RNA polimerasi Batterica RNA polimerasi DNA-dipendenti MA NON NECESSITANO DI INNESCO per avviare la trascrizione nucleoside trifosfato + RNAn ⇄ difosfato + RNAn+1 Procede in direzione 5’-3’

Polimerizzazione dei ribonucleotidi ad opera dell’RNA polimerasi durante la trascrizione L’RNA polimerasi catalizza un legame fosfodiestere tra il gruppo 3’OH libero dell’RNA nascente ed il fosfato in alfa del nuovo ribonucleotide

Stadi della Trascrizione Fase di inizio Fase di allungamento Fase di Terminazione

RNA polimerasi batterica Apoenzima dotato di attività catalitica: 2 subunità a, b e b’ Oloenzima: Apoenzima + subunità s

Ciclo di trascrizione dell’RNA polimerasi batterica 1) L’oloenzima si lega al promotore 2) La polimerasi denatura il DNA al sito di inizio della trascrizione. 3) La polimerasi inizia a trascrivere (Trascrizione Abortiva) 4-5) Si stacca s e la polimerasi diventa più processiva (Fase di Allungamento) 6-7) In presenza di segnali (Terminatori) avviene il distacco della polimerasi dal DNA ed il rilascio di RNA

Sequenze Consenso per i prinicipali Promotori Batterici

La direzione dell’RNA polimerasi è determinata dall’orientamento del promotore L’ RNA polimerasi procede sempre in direzione 5’-3’

Esistono tre tipi di RNA polimerasi eucariotiche RNA polimerasi DNA-dipendenti MA NON NECESSITANO DI INNESCO per avviare la trascrizione Esistono tre tipi di RNA polimerasi eucariotiche

1) Richede l’intervento dei fattori trascrizionali basali L’RNA polimerasi II è molto simile all’RNA polimerasi batterica ma ci sono delle differenze 1) Richede l’intervento dei fattori trascrizionali basali 2) Tiene conto del compattamento del DNA nei nucleosomi I fattori trascrizionali basali, aiutano l’RNA polimerasi II a posizionarsi correttamente sul promotore. Svolgono una funzione analoga alla subunità s dell’RNA polimerasi batterica

Fasi di inizio della trascrizione eucariotica I promotori eucariotici contengono una sequenza consensus chiamata TATA box La TATA box è riconosciuta e legata da TFIID TFIID è costituita da varie subunità: TBP e TAFs TBP è responsabile del riconoscimento della TATA box TFIIB riconosce e lega l’elemento BRE del promotore

TFIIF stabilizza l’interazione dell’RNA polimerasi II con TFIID e TFIIB e recluta TFIIE TFIIE recluta TFIIH

TFIIH è dotata di attività elicasica e di fosforilazione del dominio CTD (C-terminal domain) dell’RNA polimerasi II La fosforilazione del dominio CTD (C-terminal domain) avviene al livello della serina 5

Ruoli dei fattori trascrizionali basali

Figure 6-17 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Acetilazione Istoni H3 ed H4 (Attivazione genica) Modifiche post-traduzionali delle code delle proteine istoniche possono influenzare l’espressione genica Acetilazione Istoni H3 ed H4 (Attivazione genica) Metilazione Istone H3 (Inattivazione genica) De-acetilazione Istone H3 ed H4 (Inattivazione genica)

Acetilazione, metilazione e fosforilazione degli istoni

Fattori Trascrizionali Posseggono delle particolari regioni (motivi) che legano il DNA Stabiliscono un gran numero di contatti con il DNA, coinvolgendo legami idrogeno, legami ionici ed interazioni idrofobiche Tali legami determinano un’interazione con il DNA molto forte ed altamente specifica I motivi sono generalmente costituiti da alfa eliche e foglietti beta

Motivo ELICA-GIRO-ELICA L’alfa-elica C-terminale (Rosso) si lega in modo sequenza specifica al livello del solco maggiore del DNA

Motivo a dita di Zinco

Motivo a cerniera di leucine (“Leucine Zipper”)

Motivo Elica-Ansa-Elica Tale motivo consiste di una breve alfa-elica connessa da un’ansa ad una seconda alfa-elica più lunga. La flessibilità dell’ana permette ad un’elica di ripiegarsi e di compattarsi contro l’altra. L’elica più lunga di solito è responsabile dell’interazione con il DNA

Dal Gene alla Proteina nei Procarioti ed Eucarioti

Differenze tra i trascritti procariotici e i trascritti eucariotici

Aggiunta del Cappuccio al 5’ dell’mRNA Fosfatasi Guanilil-Transferasi 7-Metil-Transferasi

Disposizione di Esoni ed Introni in differenti geni

Processo di Splicing

1° Reazione di Transesterificazione

2° Reazione di Transesterificazione

…Ricapitolando

Figure 6-31 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Sequenze consensus che dirigono il taglio e la poli-Adenilazione del 3’ del trascritto

Passaggi principali nella generazione dell’estremità 3’ di un mRNA eucariotico 1) Legate al CTD della pol II ci sono CPSF (Fattore della specificità del taglio e della poli-Adenilazione) e CsTF (Fattore di stimolazione del taglio) 2) CPSF riconosce il consenus AAUAAA; CstF richiama altri fattori di taglio che determinano il taglio del trascritto al sito CA 3) L’enzima PoliA-polimerasi (RNA polimerasi stampo-indipendente) catalizza l’aggiunta di una coda di A (circa 250 nucleotidi) al gruppo 3’OH libero del dinucleotide CA al sito di taglio 4) La coda di poli-A viene riconosciuta e legata dalle PolyA-binding protein che stabilizzo il trascritto ed impediscono che venga degradato da RNasi

Figure 6-38 (part 1 of 3) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Figure 6-38 (part 2 of 3) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Regolazione del recettore della transferrina Regolazione della ferritina Regolazione del recettore della transferrina

I trascritti dopo aver subito le modifiche del: Aggiunta del Cap di 7-metil Guanosina al 5’ Splicing Aggiunta di coda di poli-A Vengono esportati dal nucleo al citoplasma attraverso i pori nucleari

Processamento degli RNA ribosomali L’RNA polimerasi I trascrive il gene che codifica per gli rRNA 28S, 18S, 5.8S Tale gene codifica per un grosso trascritto precursore 45S che viene processato in 28S, 18S e 5.8S

Biogenesi dei microRNA I geni codificanti microRNA sono trascritti dall’ RNA polimerasi II oppure III Il trascritto contiene una o più regioni stem-loop chiamati pri-micorRNA I pri-microRNA sono processati dal complesso Drosha/DGCR8. Viene quindi liberata una struttura stem loop di 60-100 nucleotidi chiamata pre-microRNA I pre-microRNA sono esportati dal nucleo al citoplasma attraverso i pori nucleari mediante un meccanismo dipendente da Exportin5 e RAN-GTP I pre-microRNA sono processati nel citoplasma dal complesso Dicer/TRBP che forma una regione di dsRNA di 18-22 nucleotidi con le estremità 3’ sporgenti di due nucleotidi.

Il microRNA maturo viene incorporato nel complesso RISC (RNA-induced silencing complex) Nel complesso RISC viene mantenuto solo 1 filamento di RNA derivante dalla struttura di dsRNA (microRNA maturo). Questo indirizzerà il complesso RISC sull’ mRNA bersaglio. Nel caso di un appaiamento perfetto tra microRNA e mRNA (si verifica per lo più nelle piante), l’mRNA bersagli viene degradato dalle proteine Argonauta presenti nel complesso RISC Nel caso di un appaiamento non perfetto si verifica un blocco traduzionale dell’mRNA bersaglio

Codice genetico Il codice è letto in gruppi di tre nucleotidi (triplette) Ciascuna tripletta sull’mRNA è chiamato codone Il codice è ridondante: codoni diversi possono codificare per un singolo amminoacido

Per una data sequenza di RNA ci sono tre differenti quadri di lettura MA solo un quadro di lettura possibili in un mRNA codifica per una proteina!!!

Struttura del tRNA

Appaiamento codone-anticodone Fenomeno del vacillamento La terza base è oscillante

Come si forma amminoacil-tRNA? Avviene ad opera dell’Amminoacil-tRNA sintetasi mediante un processo a 2 fasi: 1) Attivazione degli amminoacidi 2) Formazione del legame esterico tra il gruppo carbossilico dell’amminoacido ed il 3’OH libero dell’adenina al livello del CCA all’estremità 3’ del tRNA

1 errore ogni 50000 accoppiamenti Meccanismo di controllo dell’amminoacil-tRNA sintetasi 1 errore ogni 50000 accoppiamenti Viene idrolizzato l’AMP dall’amminoacido non corretto e l’amminoacido viene espulso dal sito attivo dell’enzima Meccanismo analogo alla correzione esonucleolitica della DNA polimerasi

Incorporazione di un amminoacido in proteina 1) Attivazione degli amminoacidi Il legame ad alta energia tra il tRNA e l’amminoacido viene rotto ed il gruppo carbossilico così liberato forma un legame peptidico con il gruppo amminico libero dell’amminoacido successivo. Tale reazione è catalizzata dall’enzima peptidil-transferasi

Il messaggio contenuto nell’RNA è decodificato dai ribosomi

Ribosoma contiene quattro siti fondamentali: per mRNA, per amminoacil-tRNA, per peptidil-tRNA e sito di uscita per i tRNA “scaricati”

La reazione centrale della sintesi proteica è catalizzata dall’enzima peptidil-transferasi

1) L’amminoacil tRNA si lega al sito A del ribosoma 2) Formazione del legame peptidico catalizzata dalla peptidil-transferasi

3) La subunità maggiore del ribosoma trasloca rispetto alla subunità minore. Ciò porta il peptidil-tRNA al livello del sito A e il tRNA “scaricato” al livello del sito E nella subunità maggiore (posizione ibrida)

4)La subunità minore si sposta di una tripletta lungo l’mRNA 4)La subunità minore si sposta di una tripletta lungo l’mRNA. Ora il peptidil-tRNA è passato completamente nel sito A e il tRNA “scaricato” nel sito E

5) Un nuovo amminoacil-tRNA entra nel sito A mentre il tRNA scaricato esce dal sito E

Il processo di traduzione è finemente regolato EF-Tu-GTP lega e “controlla” che gli amminoacil-tRNA siano corretti. Inoltre, li guida al livello del sito A

EF-Tu induce una curvatura al tRNA per cui impedisce che possa formarsi un appaiamento incorretto

Al corretto appaiamento tra codone ed anticodone segue l’idrolisi del GTP a GDP. Ciò determina un cambio conformazionale di EF-Tu che determina la perdita di affinità verso l’amminoacil-tRNA ed il distacco dall’amminoacil-tRNA

I passaggi di correzione garantiscono una traduzione accurata al 99,99%

Fase di inizio della traduzione Il cap al 5’ e la coda di polyA del trascritto sono fondamentali per una corretta traduzione

Alla subunità minore del ribosoma si lega al livello del sito P il tRNA iniziatore che porta legato una Metionina La subunità minore scorre lungo l’mRNA alla ricerca del codone AUG Una tipica sequenza consensus di inizio della traduzione è ACCAUGG Fenomeno leaky scanning

Nei batteri il tRNA iniziatore porta una Metionina modificata (Formil-Metionina)

Fase di terminazione della traduzione Quando un codone di stop viene “letto dal ribosoma” si posizionano nel sito A del ribosoma i Fattori di rilascio della traduzione (RF) Codoni di stop: UAA, UAG, UGA

Ulteriore meccanismo di controllo traduzionale mRNA nonsense decay Un corretto splicing determina il legame sull’RNA delle proteine EJC Se il ribosoma incontra un codone di stop quando sono presenti sull’ mRNA proteine EJC queste reclutano le proteine Upf che scatenano una reazione di degradazione dell’mRNA