Le proteine enzimatiche

catalizzatori biologici I sistemi viventi sono caratterizzati da un’enorme varietà reazioni chimiche la maggior parte delle quali è mediata da una serie di eccezionali CATALIZZATORI BIOLOGICI : GLI ENZIMI L’ENZIMOLOGIA E’ UNA PARTE DELLA BIOCHIMICA CHE STUDIA GLI ENZIMI RUOLO DEGLI ENZIMI: catalizzatori biologici

Le proteine enzimatiche Gli enzimi sono catalizzatori biologici Capaci di aumentare la velocità di una reazione, anche più di un milione di volte, senza subire trasformazioni durante l’intero processo. Per la maggior parte sono proteine la cui attività catalitica dipende dall’integrità della loro conformazione proteica nativa

SEQUENZA AMINOACIDICA STRUTTURA FUNZIONE CATALISI INTERRUTTORI ELEMENTI STRUTTURALI LEGAME

Le proteine enzimatiche QUALSIASI molecola che lega una proteina prende il nome di LIGANDO I ligandi possono essere piccole molecole o macromolecole Se il ligando muta nel tempo si chiamerà SUBSTRATO e PRODOTTO il risultato del mutamento TUTTI GLI ENZIMI LEGANO IL SUBSTRATO

Le proteine enzimatiche SUBSTRATO: sostanza su cui agisce l'enzima CATALASI emoglobina Fe3+ 2 H2O2 2H2O + O2 Reazione lenta Reazione 1.000 volte più veloce se aggiungiamo ione ferrico Fe3+ Reazione 1.000.000 di volte più veloce in presenza di emoglobina, proteina contenente ferro Reazione 1 miliardo di volte più veloce in presenza di un ENZIMA: CATALASI presente in molte cellule Il catalizzatore sebbene partecipi alla reazione, rimane INALTERATO durante il processo Il catalizzatore cambia la velocità del processo, ma non influisce sulla posizione di EQUILIBRIO della reazione Un processo TERMODINAMICAMENTE FAVORITO non viene reso più favorito dal catalizzatore

Le proteine enzimatiche Gli enzimi sono ottimi catalizzatori perché: OTTIMIZZANO LA RESA: Svolgono solo le reazioni necessarie Impediscono reazioni indesiderate (specificità di substrato) Portano a termine le reazioni in tempi brevi Sono indipendenti dall’ambiente (temperatura, pressione) Riutilizzano della stessa “macchina” per molte volte MINIMIZZANO GLI SPRECHI: Non producono sottoprodotti (specificità di reazione) Minimizzano il dispendio energetico HANNO CAPACITA’ DI REGOLAZIONE che risiede nelle loro proprietà strutturali

SITO ATTIVO Le proteine enzimatiche L’ENZIMA LEGA IL SUBSTRATO IN UNA REGIONE PROTEICA SPECIFICA SITO ATTIVO Il potere catalitico di un enzima è dovuto, per la maggior parte, al legame dei substrati in un corretto orientamento

Le proteine enzimatiche Caratteristiche comuni: Il sito attivo è una regione della proteina che lega il substrato e contiene residui aminoacidici che partecipano alla catalisi Caratteristiche comuni: Occupa una parte relativamente piccola del volume totale della molecola enzimatica Entità tridimenzionale formata da gruppi che derivano da parti diverse della sequenza aminoacidica lineare I substrati si legano all’enzima mediante un certo numero di attrazioni deboli Sono cavità o fenditure (acqua normalmente esclusa se non è un reagente, carattere non polare ma può contenere residui polari) La specificità del legame dipende dalla precisa disposizione degli atomi in un sito attivo

Le proteine enzimatiche COME GLI ENZIMI FUNZIONANO DA CATALIZZATORI Le forze attraverso le quali i substrati e le altre molecole si legano agli enzimi sono lo stesso tipo di forze che regolano la conformazione delle proteine L’enzima lega una o più molecole di SUBSTRATO e forma un complesso enzima-substrato COMPLEMENTARIETA’ GEOMETRICA ED ELETTRONICA

Modelli molecolari per spiegare come l’enzima modifichi il suo substrato E. Fischer nel 1894 propose il modello chiave-serratura che descrive in modo adeguato la specificità degli enzimi.

Un’elaborazione successiva (D Un’elaborazione successiva (D. Koshland, 1958) consentì di aumentare le conoscenze sui meccanismi catalitici: il modello ad adattamento indotto. Un’elaborazione successiva (D. Koshland, 1958) consentì di aumentare le conoscenze sui meccanismi catalitici: il modello ad adattamento indotto.

L’adattamento indotto implica distorsioni a carico sia dell’enzima che del substrato. Queste possono essere localizzate o comportare una grossa variazione conformazionale dell’enzima come nel caso dell’esochinasi.

Le proteine enzimatiche ENZIMA DIIIDOFOLATO REDUTTASI assieme al suo substrato NADP+ Tasca dell’enzima complementare al substrato La complementarietà proteina ligando è di rado così perfetta. Le interazioni tra una proteina e un ligando sono più spesso accompagnate da modificazioni conformazionali di una o di entrambe le molecole. Processo detto di adattamento indotto

Le proteine enzimatiche

Le proteine enzimatiche Anche i siti di legame del substrato subiscono cambiamenti conformazionali Variazione conformazionale indotta nell’esochinasi da parte del glucosio Gli enzimi non si limitano a posizionare e distorcere i loro substrati ma mediante specifici residui aminoacidici partecipano all’evento catalitico SITO CATALITICO

Le proteine enzimatiche Quando il processo è completato l’enzima rilascia il PRODOTTO(i) e ritorna al suo stato originale, pronto per un altro CICLO CATALITICO Oltre al substrato molti enzimi legano altre molecole necessarie per lo svolgimento della loro attività catalitica I cofattori

I cofattori Gran parte degli enzimi è costituita da una parte proteica ed una non proteica Come per l’emoglobina e la miosina, che riescono a svolgere la loro capacità di legare ossigeno solo se contengono il gruppo EME, alcuni enzimi riescono a svolgere la loro attività catalitica, grazie a questi gruppi FUNZIONALI COFATTORI

I cofattori COFATTORE GRUPPI PROSTETICI Legati fortemente Gran parte degli enzimi è costituita da una parte proteica inattiva ed una non proteica che ne determina l’attività APOENZIMA + COFATTORE = OLOENZIMA COFATTORE parte essenziale del sito attivo a cui si legano COENZIMI Molecole organiche complesse IONI ESSENZIALI ATTIVATORI legati debolmente COSUBSTRATI Legati debolmente GRUPPI PROSTETICI Legati fortemente

GRUPPI METABOLICI PENDOLARI I cofattori I cosubstrati come i substrati sono parte essenziale del sito attivo Si trasformano durante la reazione e si dissociano dal sito attivo alla fine della reazione. Sono riconvertiti poi nella forma iniziale attraverso altre reazioni enzimatiche. GRUPPI METABOLICI PENDOLARI ATP + glucosio ADP + glucosio-fosfato L’ADP viene rifosforilato ad ATP in altre reazioni Il glucosio-fosfato viene ulteriormente trasformato cosubstrati

è permanentemente legato all’apoenzima I cofattori Il gruppo prostetico è permanentemente legato all’apoenzima Ed affinché l’oloenzima continui ad essere cataliticamente attivo il gruppo prostetico deve essere rigenerato nella sua forma iniziale, così come un qualsiasi residuo del sito attivo che partecipi alla catalisi

VITAMINE I cofattori INSOLUBILI   I cofattori INSOLUBILI Vitamin A Vitamin D Vitamin E Vitamin K Le VITAMINE che vengono assunte con l’alimentazione sono composti organici essenziali ai processi biologici degli organismi superiori che non possono sintetizzarli VITAMINE SOLUBILI Tiamina (B1) Riboflavina (B2) Niacina (B3) Acido Pantotenico (B5) Piridoxina (B6) Biotina Cobalamina (B12) Acido Folico Acido Ascorbico Molte vitamine sono precursori di COFATTORI (vitamine idrosolubili) altre pur giocando un ruolo fisiologico essenziale non lo sono (vitamine liposolubili).

VITAMINEPRECURSORI DI COENZIMI I cofattori VITAMINEPRECURSORI DI COENZIMI

Tiamina pirofosfatasi Conosciuta anche come Vit.B1 È rapidamente convertita nella sua forma biologicamente attiva tiamina pirofosfato Tiamina pirofosfatasi 1,0-1.5 mg/giorno nell’individuo adulto beriberi

I cofattori METALLOENZIMI Molti enzimi contengono ioni metallici, solitamente legati con legame di coordinazione a catene laterali aminoacidiche e talvolta legati a gruppi prostetici IONI METALLICI NEGLI ENZIMI I metalli funzionano come i coenzimi, facendo assumere ai metalloenzimi proprietà catalitiche che non potrebbe possedere in loro assenza. In molte reazioni enzimatiche certi ioni sono necessari per l’EFFICIENZA CATALITICA. Molti enzimi che accoppiano l’IDROLISI dell’ ATP ad altri processi biochimici richiedono Mg2+ per funzionare in modo efficiente. Il complesso Mg-ATP è substrato migliore dell’ATP da solo

SITO ATTIVO E SITO CATALITICO L’atomo di zinco serve da catalizzatore metallico per promuovere l’idrolisi. Il legame scisso è indicato da un piccolo cuneo rosso CARBOSSIPEPTIDASI IN ALTRI CASI IL METALLO PRESENTE NELL’ENZIMA SERVE DA AGENTE OSSIDO-RIDUTTIVO

NOMENCLATURA DEGLI ENZIMI Quasi tutti gli enzimi sono nominati aggiungendo il suffisso –asi al nome del substrato od ad una frase che specifica la reazione catalitica dell’enzima UREASI catalizza l’idrolisi dell’urea ALCOL DEIDROGENASI catalizza l’ossidazione degli alcoli alle loro corrispondenti aldeidi L’esistenza di un enorme numero di enzimi ha portato la Commissione degli Enzimi dell’Unione Internazionale di Biochimica ad elaborare di un sistema razionale di nomenclatura International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUMB) OSSIDOREDUTTASI ossidoriduzione TRANSFERASI trasferimento di gruppi funzionali IDROLASI idrolisi LIASI rimozione o aggiunta di un gruppo al doppio legame o altre scissioni ISOMERASI riarrangiamenti intramolecolari LIGASI fusione di due molecole

Classificazione degli Enzimi http://www.expasy.org/enzyme Nome raccomandato e nome sistematico. Numero di Classificazione: Numero a quattro cifre preceduto da EC (Enzyme Commission: la prima cifra indica la classe, la seconda la sotto-classe, la terza la sotto-sotto-classe, la quarta il numero seriale).

Ad ogni enzima sono associati 4 NUMERI EC 6.4.1.1. Numero di serie Classe Sottoclasse Sotto-sottoclasse PEPTIDIL-L-AMMINOACIDO-IDROLASI E.C.3.4.17.1 CARBOSSIPEPTIDASI A Enzyme commition

Estremità non riducente CHINASI Glucosio-6-P glucosio + Pi Glucosio-6-fosfatasi FOSFATASI Estremità non riducente Fosforilasi

IDROLISI IDROLASI FOSFOROLISI FOSFORILASI Rottura di un legame covalente mediato dall’ACQUA FOSFOROLISI FOSFORILASI Rottura di un legame covalente mediato dal FOSFATO

misura della velocità di reazione

Velocità di reazione. Consideriamo una generica reazione Esprimiamo perciò la velocità di un processo chimico in un certo periodo di tempo tramite il rapporto tra la variazione di concentrazione di un reagente o di un prodotto ed il valore di quell' intervallo di tempo. L' espressione matematica della velocità di reazione è la seguente:

Riferendoci ad una concentrazione generica C La velocità di reazione v può essere determinata dalla variazione della quantità di C nell'unità di tempo: v = ½ d C / d t½ CINETICA TEMPORALE Misure sperimentali

CINETICA TEMPORALE

Velocità di Reazione Ma dipendente come o quanto? La velocità è dunque dipendente dalla concentrazione del reagente Ma dipendente come o quanto?

EQUAZIONE DI VELOCITA’ Se v aumenta proporzionalmente al crescere della concentrazione di C, si dice che la reazione è del primo ordine rispetto a C; la K di velocità è del I° ordine ed è data dalla pendenza della retta v = K C C P a) i punti rossi rappresentano dati ottenuti sperimentalmente misurando la velocità a concentrazioni diverse di C; la K è data dalla pendenza della retta che si ottiene ottimizzando la retta individuata dai punti sperimentali; i punti non giacciono tutti esattamente sulla retta dato che sono soggetti a errori sperimentali. Misure sperimentali a diversa concentrazione di C Cinetica temporale EQUAZIONE DI VELOCITA’ V = K [C]

Ordine di reazione

DA COSA DIPENDE LA VELOCITA' DI UNA REAZIONE ?? teoria degli urti efficaci o teoria delle collisioni

Rottura di legami e formazione di nuovi legami COLLISIONE TRA DUE MOLECOLE Urto insufficiente Urto sufficiente o efficace Rottura di legami e formazione di nuovi legami Aumento della concentrazione Aumento della temperatura

Si rompono e si formano legami v dipenderà dalla natura dei legami VELOCITA' DI REAZIONE Fattori che influenzano la velocità di reazione Si rompono e si formano legami v dipenderà dalla natura dei legami  NATURA DEI REAGENTI k OMOGENEE - fasi uguali ETEROGENEE - fasi diverse CAPACITA’ DEI REAGENTI DI INCONTRARSI con la concentrazione varia il numero di collisioni possibili CONCENTRAZIONE DEI REAGENTI

velocità = K[Cl][NO2Cl] NO2Cl + Cl NO2 + Cl2 Collisione che non può produrre una molecola di Cl2 b) Collisione che produce Cl2 e NO2 Se venisse raddoppiata la [NO2Cl] si avrebbe un numero doppio di possibili collisioni così come se si raddoppiasse la [Cl]. Questo significa che la velocità dipenderà da entrambe le concentrazioni elevate alla prima potenza. velocità = K[Cl][NO2Cl]

PRESENZA DI CATALIZZATORI con la T varia il numero di urti efficaci, dato che cambia l'energia cinetica TEMPERATURA O PRESSIONE DEL SISTEMA Particolari sostanze non richieste dalla stechiometria della reazione PRESENZA DI CATALIZZATORI

Da cosa è determinata la velocità di reazione? stati di transizione Da cosa è determinata la velocità di reazione? La TERMODINAMICA studia le trasformazioni ENERGETICHE delle reazioni ma non dice niente riguardo alla velocità di reazione, dice soltanto se una reazione può avvenire spontaneamente o no (reazione ESOERGONICA o ENDOERGONICA ) Ciò che può avere importanza nel determinare la velocità di un processo è quello che accade nella TRANSIZIONE dei reagenti a prodotti

coordinate di Reazione Energia Libera in funzione delle coordinate di Reazione

I reagenti formano il complesso attivato catalisi enzimatica Stato di transizione I reagenti formano il complesso attivato G Allo STATO DI TRANSIZIONE i reagenti che hanno superato lo SCOGLIO ENERGETICO possono evolvere verso la formazione dei prodotti o tornare alla formazione dei reagenti A + B P + Q G‡ = ENERGIA LIBERA DI ATTIVAZIONE Energia necessaria per portare le molecole dei reagenti allo stato di attivazione

Abbassando la barriera energetica ENERGIA DI ATTIVAZIONE G0‡ Energia libera supplementare che le molecole devono possedere per raggiungere lo STATO DI TRANSIZIONE Se la BARRIERA ENERGETICA da superare è alta, solo una piccola frazione di molecole sarà in grado di oltrepassarla COME AGGIRARE L’OSTACOLO Aumentando l’energia cinetica delle molecole Abbassando la barriera energetica Un CATALIZZATORE abbassa la barriera energetica di una reazione, aumentando di conseguenza il numero di molecole che hanno abbastanza energia per raggiungere lo stato di transizione e rendendo la reazione più veloce in entrambe le direzioni

reazioni a più stadi Velocità = K [NO2Cl] 2 NO2 Cl 2NO2 + Cl2 Stadio lento 2 NO2 Cl NO2 + Cl NO2 Cl + Cl NO2 + Cl2 QUANDO UNA REAZIONE AVVIENE A PIU’ STADI LO STADIO PIU’ LENTO DETERMINA LA VELOCITA’ DI REAZIONE Velocità = K [NO2Cl]

Le reazioni a molte tappe hanno una tappa che determina la velocità

Catalisi

Si rompono e si formano nuovi legami Stato di transizione COMPLESSO ATTIVATO A2 + B2 2 AB Si rompono e si formano nuovi legami

GLI ENZIMI CATALIZZATORI BIOLOGICI Si combinano transientemente col substrato e ne abbassano l’energia di attivazione Non spostano l’equilibrio della reazione, ma aumentano la velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto Non subiscono modificazioni permanenti durante la reazione e sono subito disponibili per catalizzare un nuovo ciclo di reazione

Gli enzimi sono biocatalizzatori che possono accelerare la velocità delle reazioni chimiche da 106 a 1017 volte. Gli Enzimi sono specifici sia per il tipo di reazione catalizzata che per la scelta dei reagenti, chiamati substrati. Normalmente un enzima catalizza solo un tipo di reazione chimica o una serie di reazioni strettamente correlate. Rispetto ai catalizzatori chimici vi sono condizioni di reazione più moderate. Nella maggior parte delle reazioni enzimatiche non vi è la formazione di sottoprodotti inutili come avviene spesso nelle reazioni non catalizzate. Gli enzimi hanno capacità di regolazione della loro attività.