L’operone lac I P O Z Y A Geni strutturali lacZ: b-galattosidasi DNA mRNA proteine lacZ: b-galattosidasi lacY: b-galattoside permeasi lacA: b-galattoside transacetilasi Geni strutturali mRNA policistronico regolazione coordinata: tutti i geni si esprimono all’unisono Il gene regolatore lacI codifica per la proteina regolatrice (repressore)

Induzione: sintesi di enzimi in risposta alla comparsa di un substrato specifico Cellule di E. coli, in assenza di lattosio, contengono poche molecole di b-galattosidasi (<5) In presenza di lattosio , nel giro di pochi minuti, vengono sintetizzate fino a 5000 molecole di b-galattosidasi (5-10% delle proteine totali) glucosio galattosio La molecola che causa la produzione dell’enzima capace di metabolizzarla è chiamata induttore lattosio La capacità di agire da induttore è altamente specifica. Molecole strutturalmente affini al lattosio possono agire da induttori della b-galattosidasi ma non vengono metabolizzate: una molecola con questa caratteristica è chiamata induttore gratuito (IPTG) Se l’induttore è rimosso la sintesi degli enzimi si blocca

Z Y A O P I repressore RNApolimerasi Il repressore previene la trascrizione legandosi a una sequenza di DNA chiamata operatore. L’operone lac è sottoposto a regolazione negativa In presenza della proteina regolatrice è bloccata la trascrizione dei geni strutturali. La proteina regolatrice prende il nome di repressore

In che modo l’operone lac risponde all’induttore? Z Y A O P I induttore Il repressore ha due siti di legame: un sito per il legame all’operatore e il secondo per il legame dell’induttore Quando il repressore lega l’induttore subisce una modificazione conformazionale che porta ad una diminuita affinità per il sito operatore (esempio di controllo allosterico)

Mutazioni a carico dell’operatore Y A O P I repressore Mutazioni nel gene O (Oc) portano all’espressione costitutiva dei geni strutturali: vengono trascritti in assenza dell’induttore Costitutivi sono gli enzimi il cui livello è costante in tutte le condizioni di crescita

Mutazioni a carico del repressore Y A O P I repressore Mutazioni nel gene I (Ic), a carico del sito di riconoscimento dell’operatore, portano all’espressione costitutiva dei geni strutturali

Mutazioni a carico del repressore Y A O P I repressore induttore Mutazioni nel gene I (IS), a carico del sito di riconoscimento dell’induttore, sono responsabili della super-repressione: i geni strutturali non vengono più indotti in presenza dell’induttore

La regolazione positiva dell’espressione genica Nel controllo positivo, la proteina regolatrice promuove il legame della RNA-polimerasi al promotore gene1 gene2 gene3 gene regolatore P “activator binding site” induttore induttore RNApolimerasi attivatore L’attivatore non si lega al DNA in assenza dell’induttore B151

Trascrizione reprimibile L’operone triptofano trpR P O trpE trpD trpC trpB trpB repressore attivo repressore inattivo triptofano L’operone è sotto il controllo negativo del repressore codificato dal gene trpR Il triptofano agisce come corepressore, attivando il repressore e bloccando la trascrizione P262

L’attenuazione della trascrizione L’operone triptofano trpR P O trpE trpD trpC trpB trpB leader 162 nt codoni trp 1 2 3 4 mRNA peptide leader (14AA) attenuatore

1 2 3 4 1 2 3 4 2 3 1 4 mRNA Attenuatore (terminatore della trascrizione) UUUUUUU Se al segmento 1 viene impedito di appaiarsi con il segmento 2, quest’ultimo si appaia con il segmento 3. Il 4 rimane singolo e non si forma il terminatore 2 3 1 4

Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide leader regola l’attività della RNA polimerasi peptide leader AUG 1 2 3 4 UGA mRNA Se è presente sufficiente triptofano il ribosoma sintetizzerà il peptide leader arrivando fino al codone di stop. Il ribosoma sporge sul segmento 2 impedendogli l’appaiamento con il segmento 3 3 4 AUG 1 2 UGA

La polimerasi continua 2 3 La polimerasi termina la trascrizione 2 3 4 2 3 4

Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide leader regola l’attività della RNA polimerasi peptide leader AUG 1 2 3 4 UGA mRNA Se manca il triptofano, il ribosoma si fermerà in corrispondenza dei 2 codoni trp adiacenti impedendo al segmento 1 di appaiarsi con 2. Il segmento 2 si associa con il segmento 3 2 3 4 AUG 1 UGA

Agendo insieme, repressione e attenuazione possono coordinare la velocità di sintesi degli enzimi biosintetici per gli amminoacidi con la disponibilità degli amminoacidi e la velocità globale della sintesi proteica. Quando il triptofano è presente ad alte concentrazioni, qualsiasi RNA polimerasi non bloccata dal repressore probabilmente non oltrepasserà la sequenza dell’attenuatore. La repressione riduce la trascrizione di circa 70 volte e l’attenuazione la riduce ulteriormente di 8-10 volte: quando entrambi i meccanismi operani insieme, la trascrizione può essere ridotta di circa 600 volte. Sembra che l’attenuazione abbia un ruolo importante nella regolazione della biosintesi di molti amminoacidi Prescott pag. 262