TOSSICOLOGIA La tossicologia può definirsi come quella branca delle discipline mediche che studia la natura, gli effetti, le proprietà e le dosi delle sostanze tossiche.

Definizione di tossico Un tossico è una sostanza chimica che, una volta venuta a contatto con un sistema biologico, determina una alterazione dello stato fisiologico non desiderata Intossicazione Per “intossicazione” s’intende una malattia acuta o cronica che si produce a seguito dell’esposizione dell’organismo ad una sostanza tossica. L’intossicazione è un fenomeno complesso ed è il risultato di processi che riguardano la sostanza, l’organismo e l’interazione tra sostanza ed organismo per la cui comprensione è necessario conoscere la chimica, la biochimica, la biologia, la fisiologia.

Intossicazione L’elemento che differenzia l’intossicazione da altre alterazioni dello stato fisiologico causate da altra natura (traumatica, infettiva, degenerativa) è l’estraneità (in senso qualitativo o quantitativo) dell’agente eziologico, intendendo come estranea una sostanza chimica che non è normalmente presente in un organismo o presente a concentrazioni non fisiologiche. Il concetto di estraneo (quantità e qualità) deve essere correlato sempre alla definizione di dose

Filippo Aureolo Paracelso (1493-1541) NESSUNA SOSTANZA E’ UN VELENO DI PER SE STESSA, MA E’ LA DOSE CHE FA DELLA SOSTANZA UN VELENO. Filippo Aureolo Paracelso (1493-1541)

Ets = Cs (b) (t)* R (n)* AF(sr)

Fattori che influenzano la risposta tossicologica Fattori relativi alla sostanza (dose, caratteristiche molecolari, meccanismo d’azione) B) Fattori relativi all’individuo (Vie di contatto o assunzione, tossicocinetica, soggetto) C) Fattori relativi al tempo di contatto con la sostanza tossica che permettono di distinguere la natura acuta o cronica dell’intossicazione

Fattori relativi alla sostanza 1) Dose 2) Struttura molecolare 3) Meccanismo d’azione

Cos’è la dose? mg/kg o ml/kg è definita come quella QUANTITA’ DI SOSTANZA ESPRESSA IN UNITA’ DI PESO O DI VOLUME PER UNITA’ DI PESO CORPOREO mg/kg o ml/kg

Unità di misura Dose Concentrazioni

DL50 DT50 (Dose Letale 50 o Dose Letale media) (Dose Tossica 50 o Dose Tossica media) è definita come quella dose CHE SOMMINISTRATA IN UNA DETERMINATA SPECIE PER UNA DETERMINATA VIA E’ IN GRADO DI DETERMINARE LA MORTE (un determinato effetto tossico misurabile) DEL (nel) 50% DEGLI ANIMALI TRATTATI

Classificazione delle sostanze in categorie correlate alla loro tossicità Indice di tossicità Terminologia di uso corrente Probabile dose letale in uomo di 70 kg 6 supertossiche <5mg/kg 5 altamente tossiche 5-50 mg/kg 4 molto tossiche 50-500 mg/kg 3 moderatamente tossiche 0,5-5 g/kg 2 leggermente tossiche 5-15 g/kg 1 praticamente atossiche >15 g/kg Le dosi sono estrapolate da osservazioni cliniche e dai valori delle DL50 ottenute in varie specie animali

Livello di Tossicità Esempio DL50 (mg/kg) Leggermente tossico Etanolo 8.000 (5-15 g/kg) Moderatamente tossico Cloruro di sodio 4.000 (0,5-5 g/kg) Solfato ferroso 1.500 Malathion 1.300 Metanolo 1.000 Molto tossico (50-500 mg/kg) Acido acetilsalicilico 300 Acetaminofene 300 Diazinone 200 Fenobarbitale 150 Imipramina 65 Estremamente tossico Teofillina 50 (5-50 mg/kg) Difenidramina 25 Super tossico Cianuro di potassio 3 (<5 mg/kg) Metotressato 3 Stricnina 2 Nicotina 1 Digossina 0.2 d-Tubocurarina 0.05 Tetrodossina 0.01 TCDD (diossina) 0.001 Tossina botulinica 0.00001 Classificazione delle sostanze tossiche in relazione al loro potenziale tossico

Efficacia, Tossicità, Letalità ED50 – Dose Efficace 50; la dose a cui il 50% della popolazione o del campione manifesta un determinato effetto; usato con curve dose risposta quantali • TD50 - Dose Tossica 50 - la dose a cui il 50% della popolazione o del campione manifesta un determinato effetto tossico • • DL50 - Dose Letale 50 – la dose che porta a morte il 50% dei soggetti

Tossicità acuta o immediata

Ets = Cs (b) (t)* R (n)* AF(sr) Per tossicocinetica si intende le variazioni delle concentrazioni tissutali nel tempo della sostanza (tossico). Queste variazioni sono il risultato dei processi di assorbimento, distribuzione, metabolizzazione ed eliminazione della sostanza dall’organismo (ambiente) Per Tossicodinamia si intendono le modifiche di tipo biochimico che la sostanza tossica determna nell’organismo (ambiente)

Relazione concentrazione, tempo ed effetto L’effetto di uno xenobiotico è proporzionale alla sua concentrazione nell’organo bersaglio e, in genere, al tempo di permanenza nell’organo. Dato che la concentrazione in un organo è in genere proporzionale alla concentrazione plasmatica, l’effetto è proporzionale a quest’ultima (che è misurabile). Per quasi tutti i tossici esiste una concentrazione minima, al di sotto della quale non si ha effetto.

Il fattore tempo: la relazione tra la durata dell’effetto di un tossico e la sua permanenza nell’organismo dipende dal meccanismo d’azione. Per tossici che agiscono legandosi reversibilmente a recettori, l’effetto è condizionato alla presenza nell’organismo (N.B. il danno ‘secondario’ prodotto può essere irreversibile).

Per tossici che si legano o alterano irreversibilmente i recettori e altre macromolecole biologiche (es. inibitori suicidi; metaboliti reattivi), l’effetto si mantiene anche dopo che il tossico non legato è stato eliminato; l’effetto può essere irreversibile  meccanismi di riparazione. Sostanze che modulano l’espressione genica (legandosi ai recettori per i fattori di crescita e i recettori intracellulari): il loro effetto perdura anche dopo che il farmaco è stato eliminato.

TOSSICOCINETICA Descrive i processi di assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione (ADME) degli xenobiotici. L’assorbimento è il processo tramite cui lo xenobiotico penetra nell’organismo (sangue) dal sito di esposizione. La distribuzione è il processo di passaggio dal sangue ai vari organi e tessuti.

TOSSICOCINETICA Assorbimento Distribuzione Studia i movimenti del tossico nell’organismo. Le varie fasi della cinetica di un tossico sono: Assorbimento Passaggio del tossico dall’esteno al sangue attraverso le membrane biologiche Distribuzione Distribuzione del tossico dal sangue ai diversi compartimenti dell’organismo Metabolismo o Biotrasformazione Modificazioni chimiche che il tossico subisce nell’organismo, principalmente ad opera di enzimi appartenenti al genoma dell’organismo Escrezione Eliminazione del tossico dall’organismo

ASSORBIMENTO L’entità e la velocità di assorbimento di un tossico dipendono essenzialmente dalla: 1. Via di introduzione Forme chimiche liposolubilità Per la via orale dal pH dell’ambiente e dalla costante di dissociazione del farmaco (pKa)

L’ASSORBIMENTO Caratteriste: massa molecolare, stato fisico, carica, stabilità, solubilità…. Proprietà dell’organismo: morfologia e dimensioni della superficie assorbente, perfusione dell’area assorbente, specie, razza, età, stato nutrizionale, stato di salute….. Caratteristiche dell’esposizione: dose, via, durata del contatto con la superficie assorbente…. Fattori esogeni: formulazione, interazione con altre sostanze condizioni fisiche (es. temperatura)…..

Schema della morfologia strutturale delle membrane cellulari Proteine Canali Code molecolari lipofile Teste molecolari idrofile

caratteristiche chimiche fisiche delle molecolare La struttura molecolare e le caratteristiche chimico-fisiche condiziona la tossicocinetica e la tossicodinamica

Diffusione degli xenobiotici nell’organismo Il movimento degli xenobiotici nei fluidi biologici e attraverso le membrane biologiche avviene principalmente per diffusione (passiva). Il passaggio attraverso le membrane è il passaggio limitante la velocità di diffusione globale. La diffusione avviene secondo la legge di Fick: Flusso molare (moli/sec) = (c1 – c2) x D x A/d c1 - c2 = gradiente di concentrazione (moli/l) D = coefficiente di diffusione (cm2/sec) A = area (della membrana) (cm2) d = spessore (della membrana) (cm)

La velocità di diffusione è: linearmente proporzionale al gradiente di concentrazione, che è la ‘forza motrice’ della diffusione; linearmente proporzionale al coefficiente di diffusione; linearmente proporzionale all’area della membrana; inversamente proporzionale allo spessore della membrana; Fattore legato alle modalità di entrata Fattore determinato dalle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza e della membrana Fattori biologici, non modificabili se non in stati patologici

Gradiente di concentrazione La velocità di diffusione dipende dal gradiente di concentrazione; nel tempo, le 2 concentrazioni tendono ad equilibrarsi  diminuisce la velocità di diffusione  cinetica di I ordine.

Coefficiente di diffusione A parità di gradiente di concentrazione, la velocità di diffusione di sostanze diverse è determinata dal loro coefficiente di diffusione. Il coefficiente di diffusione attraverso una membrana è determinato dal coefficiente di ripartizione soluzione/membrana e, quindi, dalle caratteristiche chimico-fisiche della molecola e della membrana

Stomaco: pH = 1,4 Plasma: pH = 7,4 ASSORBIMENTO GASTRICO DI UN SOSTANZA ACIDA (es.: acido acetilsalicilico pKa = 3,4) Stomaco: pH = 1,4 Plasma: pH = 7,4

Lipofilia Le membrane biologiche composte principalmente da lipidi, sono attraversate tanto più velocemente tanto più elevato è il coefficiente di ripartizione lipidi/acqua, ovvero tanto più elevata è la ‘lipofilia’. Non è sperimentalmente attuabile determinare il coefficiente di ripartizione membrana/acqua, quindi per predire la velocità relativa di passaggio attraverso le membrane, si fa riferimento ai coefficienti di ripartizione ottanolo/acqua o olio di oliva/acqua. In pratica, è possibile solo descrivere in modo qualitativo, e approssimativo, la dipendenza della velocità di passaggio dalla ‘lipofilia’ del composto.

Molecole ‘molto poco lipofile’ (con coefficiente di ripartizione ‘molto’ basso) hanno una capacità ‘trascurabile’ di attraversare le membrane. Questi composti possono essere ‘altamente’ idrofili (es. sali, polioli) oppure essere ‘praticamente’ insolubili sia nei lipidi che in soluzioni acquose (es. molti peptidi e proteine). Per molecole estremamente lipofile il fattore limitante è la solubilità nelle soluzioni acquose; queste molecole possono accumularsi nello strato lipidico delle membrane. In definitiva, la maggiore velocità di passaggio attraverso le membrane si ha con molecole con lipofile ma con un certo grado di idrofilia (es. paracetamolo).

Apparato gastroenterico Principali vie di entrata di sostanze chimiche tossiche Apparato gastroenterico Orale (sublinguale rettale) Apparato respiratorio Apparato tegumentario (cute e annessi cutanei)

Schema della circolazione sanguigna dell’app. gastroenterico

FATTORI CHE CONDIZIONANO L’ASSORBIMENTO GASTROINTESTINALE Legge di azione di massa Equazione di Henderson-Hasselbach Fase farmaceutica (disintegrazione e dissoluzione) Area della superficie di assorbimento Velocità del flusso ematico Resistenza al pH gastrico, agli enzimi dello stomaco, dell’intestino e della flora intestinale Trasporto specializzato Circolo enteroepatico Effetto di primo passaggio

ASSORBIMENTO POLMONARE Molto importante dal punto di vista tossicologico (gas nervini, CO, solventi, particolato) Alta superficie di scambio alveolare: 100-200 m2 nell’uomo (come intestino tenue) Epitelio alveolare monostratificato e sottile Ampia superficie capillare (80 m2) ed elevata perfusione ematica (2,5 l/min; intestino tenue 1 l/min)    Assorbimento molto efficiente per gas e vapori  

GAS E VAPORI  Es. rapidità di effetto di anestetici volatili, gas nervini, HCN (secondi-minuti).  La velocità di assorbimento è in genere più alta della velocità di assorbimento GI.

La lipofilia è meno discriminante rispetto all’assorbimento GI perché la velocità di diffusione non è il passaggio limitante la velocità di assorbimento polmonare dei gas: gas e vapori sono in genere sufficientemente lipofili l’epitelio alveolare è molto sottile l’elevato flusso ematico assicura una rapida rimozione del gas passato nel sangue  mantenimento di un gradiente di concentrazione tra aria alveolare e sangue

Fattori protettivi. La mucosa naso-tracheale è coperta da un film fluido  vengono trattenute molecole altamente idrosolubili o altamente reattive (es. formaldeide) Molti gas e vapori non vengono metabolizzati in quantità significative e vengono escreti per via polmonare. Assorbimento ed eliminazione avvengono perciò nella stessa sede. In presenza di adeguate concentrazioni nell’aria inspirata si può raggiungere quindi dopo un certo periodo di tempo un vero equilibrio, durante il quale la velocità di assorbimento è uguale alla velocità di eliminazione.

AEROSOL Sospensioni di polveri o liquidi Deposizione  Il punto di deposizione delle particelle in sospensione lungo l’albero respiratorio dipende dalla loro velocità di sedimentazione, e quindi dalle dimensioni delle particelle. Tanto più piccole sono le particelle tanto più in profondità penetrano nell’albero respiratorio. Particelle con diametro < 1 m vengono in buona parte esalate senza depositarsi.

Le particelle con diametro > 5 m si depositano soprattutto nella regione nasofaringea: espulsione trasporto ciliare alla bocca e assorbimento GI assorbimento nel sangue tramite l’epitelio nasale   Particelle con diametro 2-5 m si depositano principalmente nella regione tracheo-bronchiale: rimozione da parte dell’epitelio ciliare espulsione o assorbimento (v. sopra)

Particelle con diametro  1 m si depositano principalmente negli alveoli: Rimozione verso la regione tracheo-bronchiale Fagocitosi da parte dei macrofagi che poi migrano verso la regione tracheo-bronchiale  reazione infiammatorio-proliferativa (amianto)  Rimozione linfatica  

ASSORBIMENTO TRANSCUTANEO La cute integra è un’ottima barriera verso molti agenti chimici. Tuttavia sostanze sia gassose che liquide possono essere assorbite attraverso la cute in quantità sufficiente a dare tossicità sistemica. L’assorbimento avviene principalmente per diffusione La superficie assorbente è 1,5-2 m2 nell’adulto Importante in tossicologia. Ad es., diversi insetticidi possono essere ben assorbiti ed hanno in passato causato morti in lavoratori agricoli. Con questa via possono essere assorbiti xenobiotici con forte eliminazione pre-sistemica per via orale

Le sostanze che vengono assorbite per via transcutanea devono passare attraverso 7 strati cellulari prima di raggiungere i capillari e i vasi linfatici del derma.  La barriera principale all’assorbimento, che limita la velocità di assorbimento, è rappresentata dallo strato più esterno dell’epidermide, lo strato corneo.  Le cellule di questo strato durante il loro ciclo, perdono il nucleo, si disidratano e la loro matrice cellulare polimerizza, dando luogo a cellule ‘secche’ e piene di cheratina. Le pareti cellulari si ispessiscono per l’inclusione di materiali chimicamente inerti. Le cellule cheratinizzate formano uno strato altamente ‘impaccato’.

BIODISPONIBILITÀ La biodisponibilità di un tossico rappresenta la percentuale della quantità di dose che raggiunge la circolazione sistemica. Ad esempio una sostanza con una biodisponibilità del 80% vuol dire che un 20% della quantità somministrata non ha raggiunto la circolazione sistemica. Questo è legato a due processi: l’assorbimento (di fatto è impossibile che una sostanza entrata attraverso il tratto GI venga assorbito completamente) e il metabolismo di primo passaggio epatico.

DISTRIBUZIONE La distribuzione è quel processo che permette alla sostanza una volta assorbita di raggiungere i vari distretti dell’organismo in concentrazioni e in tempi diversi.

Casarett & Doull Elementi di tossicologia I edizione Cap. 2 pag 5 - 19 Cap. 5 pag 57-70