Radiobiologia -Presentazione del Corso - Introduzione alla Radiobiologia cellulare - Radiobiologia in Adroterapia e Radioterapia con fotoni D. Bettega 11/01/2018

Radiobiologia Introduzione Radiobiologia : studio dell’interazione della radiazione con i sistemi biologici e degli effetti che ne derivano aspetti conoscitivi (l’effetto biologico è determinato da processi fisici, da reazioni chimiche, da una risposta biologica) -aspetti applicativi : radioprotezione (conoscere gli effetti e i loro meccanismi per ridurre i danni conseguenti l’esposizione a radiazione) radioterapia/radiochirurgia (conoscere gli effetti e i loro meccanismi per sfruttare al meglio le proprietà distruttive della radiazione, es per le cellule tumorali, salvaguardando i tessuti sani)  nuove modalità di radioterapia

Radiobiologia Il corso descrive lo stato delle conoscenze sugli effetti della radiazione a livello subcellulare e cellulare , di organi, tessuti e dell’intero organismo e le relative tecniche sperimentali e modelli interpretativi. La parte finale del corso riguarda l’applicazione di queste conoscenze agli ambiti della radioterapia e della radioprotezione . Introduzione: Assorbimento di energia del materiale biologico a seguito dell’interazione con la radiazione a vari livelli fino a quello di traccia della particella.Grandezze fisiche di interesse radiobiologico (Dose, LET , grandezze microdosimetriche) . Aspetti chimici dell’assorbimento di energia, la radiolisi dell’acqua. Effetti della radiazione a livello cellulare e subcellulare : Effetti indotti nel DNA e meccanismi di riparazione del danno radioindotto. Aberrazioni cromosomiche. Inattivazione della capacità proliferativa cellulare (morte clonogenica). Teorie e modelli della sopravvivenza cellulare. Apoptosi. Mutazioni e trasformazione neoplastica da radiazione. Instabilità genomica. Effetti “ bystander “ e adattativi . Fattori fisici, chimici e biologici che modificano la risposta cellulare alla radiazione: LET della radiazione ed Efficacia Biologica Relativa della radiazione. Distribuzione temporale della dose: effetti di frazionamento e della intensità di dose, recupero del danno subletale. Effetto ossigeno, fattore OER. Radiosensibilità nelle diverse fasi del ciclo cellulare. 3

Radiobiologia Effetti dell'esposizione a radiazione di tessuti, organi e dell’intero organismo . Effetti acuti: radiosensibilità di tessuti ed organi. Sindromi da panirradiazione. Effetti a livello prenatale. Effetti a lungo termine: effetti stocastici ( radiocancerogenesi in sistemi animali sperimentali e in popolazioni umane; effetti genetici) ed effetti non stocastici. Radiobiologia in radioterapia Crescita cellulare in tessuti normali e tumorali, modelli sperimentali. Curve dose-risposta in radioterapia. Effetti del frazionamento e dell’intensità di dose in radioterapia, calcolo delle relazioni isoeffetto. Ruolo dell’ossigeno nella risposta dei tessuti tumorali. Altri fattori che modulano la risposta del tumore alla radioterapia: dimensioni, ripopolamento, radiosensibilità intrinseca. Modelli per la previsione del controllo locale del tumore e degli effetti nei tessuti sani circostanti in funzione della dose . Proprietà fisiche e radiobiologiche di fasci di protoni e di ioni Carbonio. Fasci di protoni e ioni C per uso clinico ( adroterapia), monoenergetici e a picco di Bragg allargato (SOBP ) ,. RBE e fattori modulanti: OER , frazionamento. Modelli radiobiologici . Radiobiologia nella radioprotezione dalla radiazione spaziale L’ultima parte del corso riguarda alcuni aspetti della radiobiologia nella radioprotezione dalla radiazione spaziale ( es risposta dei sistemi biologici a ioni molto pesanti e di alta energia, centinaia di MeV/n). In questo caso il campo di radiazione è complesso e variabile in dipendenza del tipo di missione. Alcuni aspetti sono analoghi a quelli che si hanno in adroterapia. 4

fase chimica/biochimica (entro 10 -5 s) Radiobiologia cellulare L’irraggiamento di ogni sistema biologico genera una serie di eventi di natura diversa a tempi diversi dall’irraggiamento : fase fisica (entro 10 -15 s) fase chimica/biochimica (entro 10 -5 s) fase biologica(ore, giorni, mesi, anni…) 5

Radiobiologia Introduzione Fase fisica: interazione della radiazione con gli atomi e le molecole costituenti il tessuto ed in particolare la cellula. Le particelle cariche producono ionizzazioni ed eccitazioni direttamente (interazione di tipo elettrico tra la particella carica e gli elettroni degli atomi ). Radiazione che non possiede carica (X, gamma o neutroni), produce particelle cariche secondarie (elettroni nel caso di X o gamma, e principalmente protoni nel caso dei neutroni ) che a loro volta interagiscono elettricamente con gli elettroni degli atomi producendo ionizzazioni ed eccitazioni nelle molecole all’interno della cellula. Gli elettroni emessi possono a loro volta produrre altre ionizzazioni. I trasferimenti di energia sono distribuiti spazialmente in modo discontinuo lungo le tracce delle particelle cariche La quantità media di energia depositata per unità di percorso lungo la traccia della particella è chiamato LET , Linear Energy Transfer (keV/m) ( LET= dE/dx, LETr , LET  , LET ) 6

Radiobiologia Introduzione Il LET e la distribuzione spaziale delle ionizzazioni e delle eccitazioni lungo la traccia , dipende dal tipo e dall’energia della radiazione : X, gamma , elettroni producono pochi eventi di deposizione di energia per unità di percorso (sparsamente ionizzanti , di basso LET (<1-2 keV/ m)) particelle alpha , protoni di bassa energia , ioni pesanti , neutroni producono un’elevata deposizione di energia per unità di percorso (densamente ionizzanti o di alto LET ( >10 keV/ m)) DNA e tracce di particelle sparsamente e densamente ionizzanti : ionizzazioni ( tondi pieni ); eccitazioni ( punti ) 7

Radiobiologia Introduzione La grandezza fisica macroscopica che descrive la quantità di radiazione a cui un materiale biologico è stato esposto è la Dose , energia impartita dalla radiazione all’ unità di massa del materiale irradiato. Si misura in Joule / kg ( Gy ) . 5 Gy ( 5 J / kg ) è la dose media letale umana Un’energia termica di 5 J fornita ad 1 kg di acqua ne varia la temperatura di circa 10 –3 °C!!!!!!!! L’efficacia della radiazione ionizzante nella produzione del danno biologico è dovuta alla modalita’ dei trasferimenti di energia alla materia irradiata: rilascia infatti nel materiale attraversato importanti quantità di energia in modo localizzato : l’energia dissipata in 1 evento di ionizzazione è circa 30 eV , molto maggiore di quella che serve per rompere legami di tipo chimico (qualche eV). Per una Dose di 1Gy ( radiazione di basso LET, es X) circa 10 5 ionizzazioni nel nucleo cellulare(=10m) 8

Radiobiologia Introduzione Fase chimica/biochimica: Atomi e molecole danneggiati ( ionizzati) sono molto reattivi, reagiscono chimicamente con altri componenti cellulari, si hanno rotture di legami chimici, formazione di radicali liberi ed altre reazioni che possono determinare alterazione di macromolecole tra le quali il DNA . fase chimica : 10-12 s  10-6 s. Fin dal 1901 Pierre Curie osservò che le soluzioni acquose di sali radio liberano idrogeno e ossigeno. Successivamente si osservò che l’acqua irradiata è altamente reattiva, in grado di causare delle modificazioni chimiche nei composti che vengono in essa disciolti.La reattività dell’acqua irradiata è dovuta alla presenza dei radicali liberi formati a seguito dell’irraggiamento….. I nostri tessuti sono formati in gran parte di acqua!. ……… Radicali liberi sono atomi o molecole con un elettrone spaiato ( non accoppiato ad un elettrone di opposto spin). Il risultato dell’interazione di una particella ionizzante con una molecola di acqua è: H2O→ H2O+ + e- (G = 2.7 molecole / 100 eV) H2O+ → H+ + OH° ( in 10-16 - 10-10 s, prossimità della traccia) e- + H2O → H2O- → H° + OH- H° + H° → H2 Quindi l’irraggiamento dell’acqua determina inizialmente formazione di radicali H° e OH° . 9

Radiobiologia Introduzione Azione diretta della radiazione: molecole ionizzate o eccitate sono molto instabili, le configurazioni elettroniche vengono riarrangiate con conseguenti possibili interazioni con altre molecole. Azione indiretta: Formazione di molecole d’acqua ionizzate e quindi di radicali liberi (10 –12 s) che possono migrare dal luogo in cui sono stati prodotti e reagire con le molecole organiche biologiche provocando il danno prima di essere inattivati (10 –6 s). I radicali liberi acquosi sono quindi intermediari della produzione del danno alle molecole biologiche 10

Radiobiologia Introduzione Fase Biologica: La fase biologica include tutti i processi che seguono la fase chimica, all’inizio reazioni enzimatiche fino agli effetti finali sia precoci , sia tardivi. fase biologica : pochi minuti  molti anni (es. cancerogenesi). 11

Effetti della radiazione a livello cellulare Quello che sappiamo deriva in gran parte da esperimenti condotti con linee cellulari stabilizzate (popolazioni cellulari derivate da tessuti/organi di varie specie di mammifero, con caratteristiche stabili nel tempo ed illimitata capacità proliferativa). Sono modelli sperimentali relativamente semplici Esperimenti in condizioni controllate e riproducibili E’ possibile studiare vari effetti e valutare separatamente il contributo dei diversi fattori che eventualmente li modulano. Sono facilmente reperibili presso apposite Banche o Laboratori scientifici. 12

Danni al DNA La radiazione deposita energia in modo casuale nelle diverse molecole che costituiscono la cellula ma le conseguenze sono diverse. Il DNA è il bersaglio più importante ai fini degli effetti indotti dalla radiazione (determina tutte le funzioni cellulari, ed è una grossa molecola). Numerose evidenze sperimentali lo indicano come principale bersaglio. 13

Danni al DNA Il DNA è costituito da due opposte catene collegate da legami idrogeno che formano una struttura a doppia elica. Ogni catena contiene le 4 basi ( A, C, G, T) (1) in sequenza , connesse ad uno zucchero ed a un gruppo fosfato. L’ordine delle basi è il codice che determina quale proteina viene fatta ed anche se il gene è attivo ( trascritto) o no. La doppia elica si avvolge ad intervalli regolari attorno ad un complesso di una specifica classe di proteine (istoni) formando i nucleosomi.(2) Molte altre proteine sono associate al DNA : ne controllano il metabolismo incluso trascrizione, replicazione, riparo. DNA e le proteine associate costituiscono la cromatina, filamenti dispersi nel nucleo cellulare. Al momento della divisione cellulare la cromatina del nucleo cellulare ( DNA e proteine ) si avvolge in modo molto compatto fino a formare i cromosomi le cui dimensioni sono dell’ordine del micron. (3) (3) (2) (1) 14

Danni al DNA Il DNA può essere danneggiato : per azione diretta della radiazione, es ionizzazioni prodotta da un elettrone entro la macromolecola. per via indiretta, mediata dall’azione dei prodotti radiolitici dell’acqua. Le specie radicali prodotte nell’acqua diffondono ed eventualmente lo raggiungono e lo danneggiano.Tra i prodotti radicali, OH° è uno dei i più importanti. L’azione indiretta è prevalente per radiazione sparsamente ionizzante, quella diretta per radiazione densamente ionizzante. I principali tipi di danno sono: -rotture di una o entrambe le catene ( ssb e dsb) -alterazioni delle basi -alterazioni strutturali del DNA 15

Danni al DNA La rottura di una singola catena (ssb) della molecola del DNA non è immediatamente letale . Ci sono dei meccanismi di riparazione efficienti e veloci. Le singole rotture sono eventi frequenti in una cellula. Più gravi sono le rotture della doppia elica (dsb) che possono essere causate dalla rottura di entrambe le catene simultaneamente e in vicinanza a seguito di un’azione diretta che comporti una notevole deposizione di energia (alto LET) oppure dall’interazione di due ssb, piuttosto vicine ( 6-12 basi) nel tempo e nello spazio 16 16

Danni al DNA La risposta del DNA al danno è estremamente complessa, si può suddividere in due parti: -la rivelazione del danno ( sensori) -la risposta al danno I sensori del danno sono costituti da un gruppo di proteine che sorvegliano il genoma per individuare la presenza di danni. La risposta al danno si articola in tre aspetti: -eliminazione della cellula danneggiata ( processo apoptotico) -processo di riparo delle rotture. -blocco temporaneo o permanente della progressione nel ciclo cellulare (checkpoint di danno). 17

Danni al DNA Sensori di danno:evidenza dell’esistenza di un sistema di riconoscimento della presenza di danno (dsb) si ha dal fatto che nei nuclei di cellule irraggiate si ha , subito dopo l’irraggiamento, la formazione di “foci”, regioni microscopiche in cui si addensano un gran numero di proteine, che possono essere evidenziate con apposita colorazione, in corrispondenza al sito dove è avvenuta la rottura del DNA Questa proprietà ha fornito un metodo molto sensibile per rivelare le dsb e per studiare la cinetica del loro riparo . 18

Danni al DNA Foci nel nucleo di cellule umane irraggiate con ioni pesanti ( fascio parallelo al nucleo) che evidenziano l’attività di riconoscimento, da parte di apposite proteine, delle dsb formate in corrispondenza della traccia degli ioni Jacob et al (GSI ), 2003 19

Danni al DNA 2. Attivazione di check points nel ciclo cellulare Le cellule irraggiate presentano un ritardo nella progressione nel ciclo cellulare seguente l’irraggiamento ( l’entità dipende dal tipo di cellula e dal tipo di radiazione ed è lineare con la dose) Ora è noto che la ragione è l’attivazione di punti di controllo , all’interno del ciclo cellulare. Se ne conoscono 4, in G1, in S , in G2 iniziale e in G2 finale. Le cellule tumorali mancano di alcuni punti di controllo nel ciclo cellulare ( potrebbe essere importante per il frazionamento in radioterapia ) 20

Danni al DNA Una stima delle frequenze dei diversi tipi di lesioni per una dose di 1 Gy di radiazione di basso LET , è la seguente : ( Goodhead et all, Int. J. Radiat. Biol. 65, 7,1994 ; UNSCEAR 2000) 105 ionizzazioni nel nucleo 2000 ionizzazioni nel DNA 1000 rotture della singola catena 1000 danni alle basi 40 rotture delle due catene 21

Aberrazioni cromosomiche Al momento della divisione cellulare la cromatina del nucleo cellulare ( DNA e proteine ) si avvolge in modo molto compatto fino a formare i cromosomi le cui dimensioni sono dell’ordine del micron. In questa condizione è possibile vedere con un microscopio ottico eventuali rotture o alterazioni prodotte dalla radiazione (aberrazioni cromosomiche ) 22

Aberrazioni cromosomiche Metafase normale ( A) e con dicentrico (B) 23

Aberrazioni cromosomiche Due diversi cromosomi prima della replicazione Entrambe hanno una rottura I frammenti si ricongiungono in modo errato Si forma un cromosoma dicentrico e frammenti acentrici . Un’aberrazione di questo tipo comporta con grande probabilità morte cellulare 24

Aberrazioni cromosomiche Ci sono aberrazioni cromosomiche che non sono letali , ma possono essere associate ad effetti a lungo termine quali la cancerogenesi ( es le traslocazioni e le delezioni interstiziali ) 25

Aberrazioni cromosomiche Gli studi delle curve dose-effetto per le aberrazioni cromosomiche hanno mostrato che per radiazione a basso LET la frequenza di aberrazioni cresce linearmente con la dose a basse dosi , e quadraticamente con la dose alle dosi più elevate. E’ quindi rappresentabile da una funzione del tipo F = a D +b D 2, dove F è la frequenza , D la dose , a e b dei parametri. 26

Aberrazioni cromosomiche colorazione con Giemsa e FISH(Ibridazione in Situ Fluorescente ) 27

1 Gy ( radiazione X) : …… e la cellula ??? 10 5 ionizzazioni nel nucleo cellulare 2000 ionizzazioni nel DNA 1000 rotture singola elica (ssb) 1000 danni alle basi del DNA 40 rotture doppia elica (dsb) 1 aberrazione cromosomica / cellula …… e la cellula ??? 28 28

Effetti a Livello Cellulare: mortalità clonogenica Gli effetti della radiazione sulla sopravvivenza cellulare sono stati diffusamente studiati anche per l’importanza che rivestono in radioterapia. In radiobiologia sopravvivenza cellulare è definita come mantenimento della capacità proliferativa illimitata. L’alterazione della capacità proliferativa delle cellule tumorali è la base della radioterapia, quella della componente cellulare proliferante degli organi sani è la ragione degli effetti collaterali della radioterapia. Sono però noti altri processi di mortalità delle cellule esposte a radiazione, quali : Apoptosi (morte cellulare programmata) Necrosi Catastrofe mitotica 29

Tecnica per misurare la capacità proliferativa cellulare Irraggiamento cellule alla dose D Semina della sospensione cellulare a bassa densità ( in dipendenza della dose per avere 2-3 colonie / cm2) No cellule/campione (3-5 campioni / Dose) Incubazione a 37° per 8-20 giorni (in dipendenza della linea cellulare) Conteggio delle colonie (con n° cellule  50) : N Efficienza di piastramento e Sopravvivenza : EP (D)=N / No S(D) =EP(D) / EP(0) (EP(0) è l’efficienza di piastramento dei campioni di controllo) I campioni di controllo subiscono esattamente lo stesso trattamento di quelli irraggiati, salvo l’esposizione alla radiazione. 30

Per convenzione si considerano sopravvissute cellule che hanno dato origine ad una colonia con almeno 50 cellule (5-6 divisioni). Le cellule irradiate non perdono immediatamente la loro capacità proliferativa: 2 Gy 31

Perché una cellula perde la sua capacità proliferativa ? Le particelle cariche secondarie ed i radicali creati dall’interazione della radiazione con il nucleo cellulare producono una serie di danni al DNA (danni alle basi, rotture della singola elica , rotture della doppia elica…) che vengono parzialmente riparati dalla cellula . Le lesioni ritenute determinanti per la letalità sono le rotture alla doppia elica non riparabili o mal riparate. 32

La relazione Dose-Sopravvivenza Le prime misure di curve Dose-Sopravvivenza riguardarono organismi subcellulari ( virus, batteri..). Il fatto che risultassero puramente esponenziali suggerì l’ipotesi che urti (hit) diretti a carico di bersagli sensibili ( target) presenti negli organismi irradiati potessero essere la causa della loro inattivazione. Tenendo conto della natura stocastica della deposizione di energia della radiazione e supponendo che si trattasse di un processo a singola interazione, si ricavò la frazione di organismi sopravvissuti utilizzando la statistica di Poisson: S= e - k D (S = frazione di individui sopravvissuti, D= Dose,). 33

La relazione Dose-Sopravvivenza Le curve Dose- Sopravvivenza di gran parte delle linee cellulari di mammifero esposte a radiazione X risultarono più complesse : es. presentano una " spalla " alle basse dosi. Si ipotizzò quindi che per inattivare la cellula occorresse inattivare n bersagli all’interno di essa (modello multitarget a singolo hit) : S = 1- (1- e- D/ Do ) n ( Per D 0 la pendenza è nulla, ad alte dosi la curva è esponenziale) 34

La curva di sopravvivenza prevista dal modello multitarget non rappresenta bene i punti spermentali nella regione delle basse dosi dove i dati sperimentali indicano una pendenza  0. Non descrive inoltre la curvatura nella regione delle dosi medio-alte. Entrambe le regioni di dose sono meglio descritte da una funzione del tipo : S = exp (-  D -  D2), dove D può essere interpretato come il contributo all’effetto dovuto ad eventi che avvengono all’interno della stessa traccia delle particelle,mentre D2 quello dovuto ad eventi che avvengono all’interno di due diverse tracce delle particelle. La funzione S = exp (-D - D2) è stata prevista anche dalla teoria dell’azione duale della radiazione ( Rossi e Keller, 1971 ) e dal modello di Chadwick e Leenhouts (1973 ) anche se alcuni aspetti di entrambe i modelli non hanno trovato riscontro in alcuni risultati di successivi esperimenti 35

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Fattori che modulano l’effetto dell’esposizione alla radiazione Fisico : LET della radiazione, tipo di radiazione, tempo Chimico : presenza di sostanze radiosensibilizzanti o radioprotettive Biologico : fase del ciclo cellulare, caratteristiche intrinseche cellulari ( radiosensibilità)

Fattori che modulano l’effetto delll’esposizione alla radiazione: LET Dosi uguali di radiazioni diverse producono effetti quantitativamente diversi es 2 Gy fotoni riducono la sopravvivenza cellulare a circa il 50%, 2 Gy di ioni C ( LET = 218 keV/m) la riducono a circa 8%.

Efficacia Biologica Relativa Per quantificare la diversa efficacia delle radiazioni nel produrre gli effetti biologici si introduce l’efficacia biologica relativa, RBE. Per un livello di effetto indotto S, RBE di una radiazione R, rispetto ad una radiazione di riferimento X, è : RBE (R) = DX / DR Dx e DR sono rispettivamente la dose della radiazione di riferimento, X e della radiazione R che producono lo stesso livello di effetto S. (ICRU (1986) , radiazione di riferimento : 220 kVp X-rays ). Es. per produrre lo stesso livello di effetto di 2 Gy di radiazione X con una radiazione R che ha RBE = 2 occorre una dose di radiazione R pari a 1 Gy .  Qualora si vogliano utilizzare in radioterapia radiazioni diverse da quelle convenzionali, occorre conoscere con precisione, in ogni posizione, la loro efficacia biologica relativa. La dose fisica non è più sufficiente per caratterizzare gli effetti del trattamento .

Fattori che modulano l’effetto delll’esposizione alla radiazione: LET RBE dipende dal livello dell’effetto (se le due curve hanno forma diversa). Se le curve sono descritte dalla S = exp ( - α D – β D 2 ) RBE → αR / αX per D→0 RBE  K DR -½ D intermedie (per la curva X predomina il termine quadratico)

Fattori che modulano l’effetto delll’esposizione alla radiazione: LET Per radiazioni di basso LET la curva di sopravvivenza è caratterizzata da una spalla, al crescere del LET la spalla diminuisce e ai valori di LET più elevati la curva di sopravvivenza diventa esponenziale. 1:  165 keV/ m , 2: He 110 keV/ m, 3: He 88 keV/ m, , 4: He 61 keV/ m, 5: He 25 keV/ m, 6: d 20 keV/ m, 7: d 5,6 keV/ m , 8 : 250 kVpX Barendsen G.W., Current Topics in Radiation Research, IV, 293-356(1968)

Fattori che modulano l’effetto delll’esposizione alla radiazione: LET L’efficacia della radiazione aumenta all’aumentare del LET fino a circa 100 - 150 keV/m e poi diminuisce. Il LET ottimale per l’induzione degli effetti biologici corrisponde ad una distanza media tra le ionizzazioni dell’ordine del nanometro. Questa distanza è dello stesso ordine di grandezza di quella delle due catene del DNA. Valori di LET inferiori (densità di ionizzazione minori) producono danno più facilmente riparabile, valori di LET maggiori implicano spreco nella deposizione di energia (overkilling) e, a parità di dose, una diminuzione nella fluenza delle particelle.

( struttura di traccia delle particelle) Fattori che modulano l’effetto delll’esposizione alla radiazione: LET e tipo di particella ioni He,ioni C,  ioni Ne RBE S=10 % La relazione RBE-LET non è unica, dipende dal tipo di particella: il picco si sposta verso i valori di LET più elevati per gli ioni più pesanti. ( struttura di traccia delle particelle) Furusawa et al, Rad. Res.,154,485-496,(2000) 10 100 500 LET ( keV/m)

Fattori che modulano l’effetto delll’esposizione alla radiazione: tempo (frazionamento dose) Danno Subletale La sopravvivenza di cellule esposte ad una dose di radiazione X, somministrata in due o più frazioni separate da adeguati intervalli di tempo, è in generale maggiore di quella prodotta dalla stessa dose somministrata in unica frazione (recupero del danno subletale). Il recupero è completo in qualche ora (nell’esempio circa 3 ore). Il fattore di recupero RF è: RF = S( D fraz) / S( D singola) Qui RF è circa 2.

Fattori che modulano l’effetto delll’esposizione alla radiazione: tempo Curva B: Vengono somministrate dosi crescenti ad una popolazione preventivamente esposta ad una dose di 4,6 Gy (Sop.= 0,1) dopo un intervallo di tempo di 15’. Il recupero del danno subletale della prima dose non è completo. Curva C: Vengono somministrate dosi crescenti ad una popolazione preventivamente esposta ad una dose di 4,6 Gy (Sop.=0,1) dopo un intervallo di tempo di 3h. Il recupero del danno subletale della prima dose è completo. (Esperimento di Elkind e Sutton,1959 per dimostrare l’esistenza di un danno subletale).

Fattori che modulano l’effetto delll’esposizione alla radiazione: tempo Frazionamento e LET: A: dosi singole e frazionate ( 2 o3 frazioni ) di ioni C,190 keV/m  no riparo B: dosi singole ioni C,11 keV/ m C: dosi frazionate (2 frazioni (t = 3.7 h), ioni C,11 keV/ m  riparo del danno subletale (Ngo, 1980)  Frazionamento della dose in radioterapia : come adeguare la dose totale per avere lo stesso effetto con regimi di frazionamento diversi C B A

Fattori che modulano l’effetto delll’esposizione alla radiazione: tempo (intensità di dose) Per radiazione di basso LET, la sopravvivenza cellulare aumenta quando la dose viene somministrata a bassa intensità. Si ritiene che gli effetti dell’intensità di dose siano dovuti a riparazione del danno subletale. Quando la riparazione del danno subletale è totale la curva di sopravvivenza è S= exp (- D).

Si quantifica con OER ((Oxygen Enhancement Ratio) Fattori che modulano l’effetto dell’esposizione alla radiazione: ossigeno La presenza di ossigeno durante l’irraggiamento influenza fortemente l’effetto prodotto da radiazione X . Si quantifica con OER ((Oxygen Enhancement Ratio) OER = D(no O2 ) / D(+ O2 ) -E’ un fattore modificante la dose -E’ dovuto a un processo radiochimico (radicali) e non fisiologico Per raggi X OER: 2-3  Importante in radioterapia, i tumori con regioni ipossiche sono più resistenti alla radiazione dei tessuti sani ben ossigenati (purtroppo!)

Fattori che modulano l’effetto delll’esposizione alla radiazione: ossigeno Le varie specie prodotte diffondono dal punto in cui sono state prodotte Le reazioni che avvengono successivamente dipendono da molti parametri, tra cui il LET della radiazione: -per radiazione di alto LET, alta densità di ionizzazione, i radicali OH° ed H° sono molto vicini tra loro, pertanto avvengono le seguenti: H° + H° → H2 H° + OH° → H2O OH° + OH° → H2O 2 quindi aumentano i prodotti molecolari a spese dei radicali -per radiazione di basso LET, bassa densità di ionizzazione i radicali OH° sono piùdistanti tra loro. Le reazioni più probabili sono: H° + OH° → H2O

Fattori che modulano l’effetto delll’esposizione alla radiazione: ossigeno In presenza di ossigeno: H° +O2 → HO2 ° HO2 ° + HO2 ° → H2O 2 +O2 ulteriore produzione di H2O 2 In presenza di sostanze organiche : RH+ OH° → R° + H2O (produzione di radicali di molecole organiche per via indiretta) RH → RH°+ + e- → R°+ H+ + e- (produzione di radicali di molecole organiche per via diretta) In presenza di ossigeno : R° + O2 → R O2 ° ossigeno fissa il danno

OER decresce al crescere del LET. Fattori che modulano l’effetto delll’esposizione alla radiazione: ossigeno : OER e LET OER decresce al crescere del LET. Per particelle alpha OER1 per LET= 166 keV/m 166 KeV/m OER=1±0.1 110 KeV/m OER=1.3 ±0.1 5,6 KeV/m OER=2.6 ±0.2 Data from Barendsen et al. (1966) in Raju -Heavy particle Radiotherapy . Academic Press (1980).

OER e LET OER decresce al crescere del LET da 3 a circa 1.2 ( LET 20 - 600 keV/ m) Valori di circa 1.2 per LET > 200 keV/ m OER di ioni He minori dei valori degli altri ioni (struttura di traccia?). Dati di Furusawa et al. (2000) per cellule V79 e HSG ( tumore ghiandole salivarie umane) esposte a ioni C(), ioni He () e ioni Ne (). Prevalenza dell’azione diretta e minori distanze dei radicali all’interno della traccia (quindi maggiore probabilità di ricombinazione) per la radiazione ad alto LET, rispetto a quella a basso LET, possono essere cause della dipendenza OER-LET  Tumori con regioni ipossiche potrebbero beneficiare di una terapia con radiazione di alto LET

Fattori che modulano l’effetto delll’esposizione alla radiazione: fasi del ciclo cellulare Cellule esposte a radiazione X nelle diverse fasi del ciclo cellulare.hanno diversa radiosensibilità. La parte finale della fase di Sintesi è resistente, Mitosi e postsintesi ( G 2 ) sensibili . Le differenze sono significative Le differenze si attenuano nel caso di radiazione di alto LET : diversa capacità di riparazione nelle diverse fasi???

Fattori che modulano l’effetto dell’esposizione alla radiazione: radiosensibilità cellulare intrinseca Le curve RBE-LET relative a diverse linee cellulari variano in dipendenza della loro capacità riparativa. La linea che non ha capacità riparativa ( CHO-K1 mutant ) non mostra il picco LET-RBE. Quella più resistente alla radiazione X, (V79), ha il più alto picco LET- RBE . (Risultato trovato da numerosi altri laboratori con diverse particelle).  Cellule tumorali resistenti a radiazione X ottime candidate per esposizione a ioni di alto LET: Adroterapia con alto LET !!!

Basi fisiche e radiobiologiche dell’adroterapia La probabilità di curare il tumore senza indurre effetti collaterali inaccettabili aumenta massimizzando la differenza tra la dose al bersaglio e la dose ai tessuti sani coinvolti nell'irradiazione stessa ("selettività balistica" o "conformità" dell'irradiazione). 55

Adroterapia, basi fisiche Per protoni e ioni la curva : Dose lungo l’asse del fascio vs profondità del materiale attraversato è molto diversa da quella dei fotoni: si ha un picco di dose (picco di Bragg) alla fine del percorso della particella carica, L’aumento della dose con la profondità di penetrazione è una conseguenza dell’aumento dello stopping power al diminuire della velocità della particella (relazione di Bethe-Bloch ): /dE/dx/ = k z2 / β2 dove z= carica efficace dello ione β= v/c dello ione 56

Adroterapia, basi fisiche Nel caso di protoni e soprattuto di ioni , la distribuzione spaziale della dose è localizzata, quindi permette una maggiore precisione nel conformare il campo irraggiato con il bersaglio (volume occupato dal tumore). Nella figura: confronto tra la distribuzione spaziale della dose (sopra) e sopravvivenza cellulare (sotto) in funzione della profondità in acqua. Kraft et al. GSI 57

Adroterapia, basi fisiche La larghezza del picco di Bragg di protoni e ioni monoenergetici è piccola rispetto alle dimensioni usuali dei tumori da trattare. E’ necessario quindi allargare il picco di Bragg ( Spread Out Bragg Peak, SOBP). Il picco di Bragg può essere allargato: - interponendo sul percorso spessori variabili (modulazione passiva) - variando l’energia del fascio durante l’irraggiamento (modulazione attiva) 58

Adroterapia, aspetti radiobiologici RBE di fasci di protoni: Fasci di protoni di energia media ed elevata hanno LET relativamente bassi (es. 30 MeV , LET= 1.9 keV/ micron). La stessa considerazione vale per i fasci di protoni usati in terapia ( SOBP) , il LET nel picco è relativamente basso e solo nella parte distale del picco, dove i protoni si stanno arrestando , sale. Dal punto di vista radiobiologico si comportano quindi circa come i fotoni, salvo che nell’estrema parte distale del picco allargato. ICRU 2007 raccomanda per i protoni RBE =1.1 59

Adroterapia, aspetti radiobiologici RBE aumenta da 1 a 1.2 da 2 mm a 25 mm ( in accordo con i valori usati nella pratica clinica ), aumenta poi fino a 2 nella parte di discesa del picco. 60

Adroterapia, aspetti radiobiologici Quando si utilizzano in terapia particelle con efficacia diversa da quella dei fotoni, la dose fisica deve essere appropriatamente corretta: Effective Dose = Dose x RBE (Co GyE) Nel caso di questo fascio di protoni la differenza tra dose fisica e dose biologicamente efficace ( dovuta all’aumento di RBE) nella parte della discesa del picco comporta un allargamento del picco lungo l’asse di circa 1mm. 61

Adroterapia, aspetti radiobiologici Le motivazioni radiobiologiche per una terapia con fasci di ioni più pesanti dei protoni ( attualmente ioni C ) sono: - RBE maggiore di 1 nel picco di Bragg, circa 1 all’ingresso . - OER minore di quello dei fotoni o protoni - dipendenza dalle fasi del ciclo cellulare: minore - efficacia per tumori resistenti ai fotoni : maggiore

Adroterapia, aspetti radiobiologici E’ importante conoscere con precisione l’RBE del fascio utilizzato nelle diverse posizioni !!!

Adroterapia, aspetti radiobiologici Il profilo della dose fisica nel picco di Bragg allargato deve essere pianificato tenendo conto dell’aumento dell’efficacia biologica con la profondità in modo che il profilo della dose biologicamente efficace sia costante e produca un effetto omogeneo nel bersaglio

Radiobiologia e Radioterapia La radioterapia è uno dei due metodi più efficaci nel trattamento dei tumori . E’ un trattamento auspicabile per più del 50 % dei pazienti e che in molti casi ( collo, cervice, vescica , prostata e pelle ) è un’ottima alternativa alla chirurgia. Oltre all’aspetto curativo, la radioterapia viene utilizzata anche come palliativo. La radiobiologia contribuisce alla radioterapia in diversi modi: - fornendo le conoscenze per identificare i processi alla base della risposta del tessuto tumorale e di quello normale - indicando nuove modalità di radioterapia ( es. con radiazioni di alto LET) - sviluppando metodi per predire il trattamento più idoneo per il singolo paziente (radioterapia personalizzata)

Radiobiologia e Radioterapia Risposta del tumore alla radiazione Gli effetti della radiazione sui tumori sia in condizioni cliniche , sia in condizioni sperimentali possono essere descritte tramite diversi indicatori, tra cui: -controllo locale dl tumore -regressione del tumore - ritardo nella ricrescita del tumore

Radiobiologia e Radioterapia Curve dose-risposta alla radiazione dei tumori e dei tessuti sani La prima analisi teorica delle curve dose-risposta alla radiazione dei tumori e dei tessuti sani risale al 1936 (Holthusen ). Si dimostrò che le curve dose-controllo locale del tumore e quelle dose-incidenza di reazioni nei tessuti sani avevano entrambe una forma sigmoide . Diverse funzioni matematiche le possono rappresentare, tra queste quella prevista dal modello di Poisson

Radiobiologia e Radioterapia: curve dose-risposta Controllo locale dl tumore (TCP) Il controllo locale del tumore è lo scopo della radioterapia curativa in quanto ogni miglioramento nel controllo locale del tumore ha come conseguenza un prolungamento della sopravvivenza del paziente. Un tumore è controllato localmente quando tutte le cellule clonogeniche presenti sono state inattivate . Pertanto la probabilità di avere il controllo locale del tumore dipende dalla dose ed è determinata dal numero di cellule clonogeniche che sopravvivono.

Radiobiologia e Radioterapia: curve dose-risposta Probabilità di controllo locale del tumore (TCP): dipendenza dalla dose Nel 1961 Munro e Gilbert pubblicarono il modello dose-risposta di Poisson. In pratica dall’ipotesi che per curare il tumore occorresse eliminare ogni cellula tumorale clonogenica e dalla natura casuale dell’induzione di mortalità cellulare da parte della radiazione giunsero alla conclusione che la probabilità di curare il tumore dovesse dipendere solo dal numero medio di cellule clonogeniche sopravvissute all’irraggiamento. In particolare irraggiato con una dose D un certo numero di tumori , ognuno con N° cellule clonogeniche iniziali, se  è il numero medio di cellule clonogeniche per tumore sopravvissute all’irraggiamento, la frequenza di tumori con 0 cellule clonogeniche dopo l’irraggiamento è P(0) = e-  , con = N° S(D) dove S(D) è la sopravvivenza alla dose D.

Radiobiologia e Radioterapia: curve dose-risposta Inizialmente si assunse che il numero medio di cellule sopravvissute alla dose D fosse una funzione esponenziale negativa della dose D , successivamente si introdusse l’espressione della sopravvivenza prevista dal modello lineare quadratico in regime frazionato TCP = exp( - N° exp ( -alpha D- beta d D) ) dove : N° è il numero di cellule tumorali clonogeniche iniziali ( prima dell’irraggiamento) exp ( -alpha D- beta d D) è la frazione di cellule sopravvissute ad una dose totale D somministrata in n frazioni, ognuna pari a d ( D= nd), assumendo riparo totale del danno subletale, secondo il modello lineare quadratico.

Radiobiologia e Radioterapia: curve dose-risposta Probabilità di controllo locale del tumore (TCP) : dipendenza dalla dose L’andamento della probabilità di controllo locale del tumore in funzione della dose , così calcolato, è la tipica curva sigmoidale che veniva osservata nella pratica clinica . Dose TCP 100 50 Es. se =1 (numero medio di cellule clonogeniche sopravvissute /tumore =1) TCP=37%, se =0.7 TCP=50%

Fattori che modulano la risposta di tumori e tessuti sani Effetti del frazionamento della dose ( tessuti normali) E’ il primo studio sistematico sugli effetti del frazionamento della dose: ogni curva è il risultato dello studio della risposta dei tessuti normali al frazionamento della dose : per ogni frazione di dose è stata determinata la dose totale necessaria per produrre un determinato effetto ( curve isoeffetto) per effetti tardivi (linee continue) ed acuti (linee tratteggiate). La dose totale aumenta rapidamente al decrescere della dose / frazione per gli effetti tardivi. Pertanto usando dosi minori /frazione si hanno meno effetti tardivi ( riaggiustando la dose totale per mantenere costanti le reazioni acute ) Studi sperimentali su animali ( topi)

Fattori che modulano la risposta di tumori e tessuti sani Effetti del frazionamento della dose Questi andamenti sono ben descritti dal modello lineare quadratico secondo cui la sopravvivenza ad una frazione di dose d è: S(d) = exp ( -  d -  d2 ) Supponendo recupero totale tra le n frazioni ( nd=D), D dose totale S(D)= exp ( - n  d - n d 2 ) = exp ( -  D - Dd ) Pertanto l’effetto della dose D somministrata in n frazioni è: E(D) =  D +  Dd Questa equazione si può riscrivere in molti modi tra cui : D = (E/) / ( 1+ d/ (/ )) A parità di effetto, D = k / ( 1+ d/ (/ )) e la dipendenza di D da d è determinata dal rapporto / .

Fattori che modulano la risposta di tumori e tessuti sani Effetti del frazionamento della dose Dose totale isoeffettiva in funzione del numero di frazioni per a) reazioni acute della pelle (/  = 10 Gy) e per b) reazioni tardive nel rene (/  = 3 Gy) (topo). Le curve calcolate con il modello LQ fittano molto bene i dati sperimentali, mentre le rette calcolate secondo un modello ( Ellis, 1969) molto usato negli scorsi decenni sovrastimavano la dose tollerata nei casi estremi ( basse e alte dosi / frazione )