POLIMERASE CHAIN REACTION Amplificazione di specifici frammenti di DNA mediante l’uso di oligonucleotidi primer che definiscono la regione di interesse

LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA (PCR) 1 COPIA 2 COPIE 4 COPIE 8 COPIE 16 COPIE 32 COPIE 64 COPIE

LOCALIZZAZIONE DEI PRIMER DELLA PCR

SCHEMA SEMPLIFICATO DI UN CICLO DI PCR

Esempio di tre cicli di PCR

THERMOCYCLER Apparecchio che consente modifiche veloci della temperatura in un blocco in cui vengono alloggiate le provette contenenti la miscela di reazione

TIPI DI THERMOCYCLER Refrigerazione/riscaldamento del blocco Economico Lento Effetto Peltier Più rapido Più costoso

Fattori che influenzano la resa della PCR Specificità scelta dei primer, condizioni della reazione, contaminazioni Sensibilità eterogeneità genomica, presenza di inibitori, efficienza della reazione Riproducibilità standardizzazione di: preparazione del campione, protocollo di PCR, metodo di rivelazione

Curva di una reazione di PCR “plateau” 0.1 pmoli di prodotto Fase esponenziale 0.01 10 20 30 Numero di cicli

Fattori che determinano l’effetto “plateau” Inattivazione termica della polimerasi Concentrazione limitante della polimerasi Ridotta efficienza di denaturazione Innefficace “annealing” dei primer Attività esonucleasica della Taq-polimerasi Competizione per i reagenti

Inattivazione termica della polimerasi Temperatura (°C) Tempo (minuti) 92,5 130 95 40 97,5 5-6 Tempo di mantenimento del 50% di attività della polimerasi

Fattori che determinano l’effetto “plateau” Inattivazione termica della polimerasi Concentrazione limitante della polimerasi Ridotta efficienza di denaturazione Innefficace “annealing” dei primer Attività esonucleasica della Taq-polimerasi Competizione per i reagenti

Concentrazione limitante della polimerasi Con il procedere della reazione il numero di molecole di prodotto aumenta, mentre il numero di molecole di enzima libero inizia a diventare limitante Importante e la competizione per l’enzima da parte di prodotti non specifici Aumentare la specificità della reazione limita l’accumulo di prodotti aspecifici

Fattori che determinano l’effetto “plateau” Inattivazione termica della polimerasi Concentrazione limitante della polimerasi Ridotta efficienza di denaturazione Innefficace “annealing” dei primer Attività esonucleasica della Taq-polimerasi Competizione per i reagenti

Ridotta efficienza di denaturazione Con il procedere della reazione si ha una riduzione della fase di denaturazione poiché all’aumentare della concentrazione del DNA stampo aumenta la temperatura di “melting” richiesta Usare temperature troppo basse o per tempi brevi non portano ad un aumento esponenziale del target

Fattori che determinano l’effetto “plateau” Inattivazione termica della polimerasi Concentrazione limitante della polimerasi Ridotta efficienza di denaturazione Innefficace “annealing” dei primer Attività esonucleasica della Taq-polimerasi Competizione per i reagenti

Innefficace “annealing” dei primer Riduzione dell’efficienza della formazione del complesso primer-target “Annealing” aspecifico dei primer “Annealing” del prodotto

Fattori che determinano l’effetto “plateau” Inattivazione termica della polimerasi Concentrazione limitante della polimerasi Ridotta efficienza di denaturazione Innefficace “annealing” dei primer Attività esonucleasica della Taq-polimerasi Competizione per i reagenti

Attività esonucleasica della Taq-polimerasi I substrati per l’attività esonucleasica 5’3’ possono essere: il prodotto di PCR qualsiasi prodotto contiene una struttura secondaria stabile

Fattori che determinano l’effetto “plateau” Inattivazione termica della polimerasi Concentrazione limitante della polimerasi Ridotta efficienza di denaturazione Innefficace “annealing” dei primer Attività esonucleasica della Taq-polimerasi Competizione per i reagenti

Competizione per i reagenti Man mano che procede la reazione aumenta il prodotto e si riducono i reagenti verso i quali competono anche i prodotti aspecifici

Controllo di qualità in PCR Controllo positivo per verificare la funzionalità di tutti i reagenti va scelto con attenzione (la più piccola diluizione in grado di dare un risultato positivo) Controlli negativi per evidenziare eventuali risultati falsi positivi

Metodi per la rivelazione dei prodotti PCR

Metodi per la rivelazione dei prodotti PCR Elettroforesi su gel Tecniche di ibridazione Sequenza HPLC Elettroforesi capillare

Principali metodi di separazione elettroforetica Gel di agarosio PAGE elettroforesi su gel di poliacrilammide RFLP SSCP DGGE TGGE CCM

Gel di agarosio E’ un polimero lineare La visualizzazione avviene grazie alla colorazione con etidio bromuro Tale colorante contiene un gruppo planare che si intercala tra le basi del DNA dando origine ad un legame che aumenta la quantità di fluorescenza se confrontato con quello libero La distanza della banda rispetto al punto di deposizione sul gel è inversamente proporzionale alla lunghezza del frammento amplificato

Gel Electrophoresis

log m = log m0 - Krt La velocità di migrazione è inversamente proporzionale al log10 del numero di coppie di basi e dipende dalla concentrazione del gel. m = mobilità elettroforetica del DNA m0= mobilità elettroforetica libera del DNA t = concentrazione del gel Kr = Coefficiente di ritardo

Parametri che regolano la migrazione elettroforetica del DNA Dimensione molecolare del DNA Concentrazione di agarosio Conformazione del DNA Intensità della corrente di voltaggio non superiore a 5 V/cm Composizione in basi

Range di separazione in un gel contenente differenti quantità di agarosio nel gel (%w/v) delle molecole di DNA ( kb) 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2

Le tecniche elettroforetiche: Permettono solo di valutare la lunghezza del prodotto PCR in base al confronto con bande di migrazione a lunghezza nota Esiste sempre la possibilità che bande di amplificazione non previste abbiano lunghezze simili a quella attesa Non sempre il prodotto di PCR è omogeneo visibile sul gel come una singola banda

Amplification Fragment Length Polymorphisms Restriction digestion (AmpFLPs) (1) Normal DNA (2) Mutant DNA PCR Product Restriction digestion analysis 1 2 3 SM

ELETTROFORESI CAPILLARE Gel in un capillare di metallo (diametro inf. a 1 mm) Migrazione veloce Capillare può essere riutilizzato

elettroforesi capillare Schema di apparato per elettroforesi capillare

Funzionamento dell’elettroforesi capillare Una piccola quantita di soluzione contenente il campione viene introdotta all’estremità anodica. Per la separazione viene applicato una differenza di potenziale tra le due estremità del capillare. Le molecole migrano con velocità differenti lungo il capillare verso l’elettrodo di carica negativa. Gli analiti sebbene siano separati in base alla velocità di migrazione elettroforetica, vengono spinti verso il catodo per il fenomeno dell’elettroosmosi.

Funzionamento dell’elettroforesi capillare La velocità del flusso elettroosmotico è più elevata della velocità di migrazione degli analiti: tutti gli ioni, indipendentemente dalla carica si spostano verso il catodo. Le molecole con carica positiva raggiungono il catodo più velocemente (migrazione elettroforetica e flusso elettroosmotico si sommano). In vicinanza del catodo le molecole attraversano una finestra dove ne viene rivelato il passaggio attraverso varie tecniche.

PCR QUANTITATIVA Analisi della quantità di un acido nucleico presente in una soluzione Prodotto di reazione proporzionale alla quantità di substrato nella fase di amplificazione esponenziale

Quantizzazione di un acido nucleico mediante PCR “plateau” 0.1 pmoli di prodotto Fase esponenziale 0.01 10 20 30 Numero di cicli

SISTEMA TAQMAN Basata su un oligo interno al prodotto di PCR marcato con due pigmenti fluorescenti Degradazione dell’oligo proporzionale al prodotto di amplificazione

FASI DELLA REAZIONE TAQMAN

QUANTIZZAZIONE MEDIANTE TAQMAN

SISTEMA LIGHTCYCLER Basata su due oligo interni al prodotto di PCR marcati con due pigmenti fluorescenti Appaiamento degli oligo in tandem proporzionale al prodotto di amplificazione

APPARECCHIO LIGHTCYCLER

SISTEMA LIGHTCYCLER

SISTEMA LIGHTCYCLER

CURVE LIGHTCYCLER

ANALISI DI CURVE DI MELTING