Elettroforesi Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine, Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico.

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1 Elettroforesi Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine, Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico

2 Principio: Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico. Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA. Forza elettrica : Fel = q · E Forza frizionale : Ffr = f ·v (f = 6 r ) Quando le forze si bilanciano: q ·E = f ·v q  v = — · E f v q mobilità elettroforetica :  = — = — E f

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4 Applicando un campo elettrico si può avere effetto Joule: V = R I
W = R I2 Operare a I costante Dissipare l’eccesso di calore

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6 Acidi nucleici

7 ELETTROFORESI SU SUPPORTO
su carta su gel

8 Formazione di un gel di poliacrilammide
CH2

9 Acrilamide, bisacrilamide  monomeri
Ione perossodisolfato  iniziatore TEMED  catalizzatore L’ossigeno è un radicale, quindi interferisce con la polimerizzazione

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11 Effetto “setaccio” in un gel uniforme

12 MOBILITA’ ELETTROFORETICA ED EFFETTO “SETACCIO MOLECOLARE”
Se q  L,  in assenza di gel e’ pressoché indipendente dalle dimensioni molecolari

13 Visualizzazione del DNA: etidio bromuro
luce UV

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15 (Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)
SDS-PAGE (Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare

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18 Colorazione con Coomassie
Colorazione con nitrato di Ag Si possono effettuare valutazioni quantitative delle bande proteiche col densitometro: misurazione della luce trasmessa quando un raggio luminoso è fatto passare attraverso il gel colorato. Si hanno picchi di assorbimento di cui si può calcolare l’area che è proporzionale alla quantità di proteina

19 Applicazioni della SDS-PAGE
Purezza del campione Determinazione del PM Western blot Purificazione della proteina

20 Applicazioni dell’SDS-PAGE
Determinazione del PM

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28 Elettroforesi delle proteine plasmatiche