I FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA MICROBICA

Caratteristiche del substrato cui il del microrganismo vive Caratteristiche di altri organismi presenti nello stesso ambiente Caratteristiche proprie del microrganismo Caratteristiche dell’ambiente in cui il substrato è collocato

DEFINIZIONE DI ALIMENTO Sono chiamati alimenti tutte quelle sostanze che l'organismo assume dall'esterno e che sono capaci, da soli o convenientemente associati, di soddisfare i suoi fabbisogni materiali, energetici e "bioregolatori".

AD ESCLUSIONE DI ACQUA E CLORURO DI SODIO TUTTI GLI ALIMENTI HANNO ORIGINE ORGANICA, SIA ESSA ANIMALE O VEGETALE

ORIGINE DEI MICRORGANISMI NEI PRODOTTI ALIMENTARI MATERIE PRIME ACQUA ARIA E POLVERE SUOLO UOMO AMBIENTE DI FABBRICA ALTRI VETTORI

FATTORI CHE INFLUENZANO LA VITA DEI MICRORGANISMI IN UN ALIMENTO FATTORI INTRINSECI FATTORI IMPLICITI FATTORI ESTRINSECI

FATTORI INTRINSECI ATTIVITA’ DELL’ACQUA (aw) pH ESPRESSIONE DELLE CARATTERISTICHE FISICHE, CHIMICHE E BIOLOGICHE DELL’ALIMENTO (substrato) ATTIVITA’ DELL’ACQUA (aw) pH POTENZIALE DI OSSIDORIDUZIONE (Eh) CONTENUTO IN NUTRIENTI PRESENZA DI INIBITORI STRUTTURE FISICHE DELL’ALIMENTO

ESPRESSIONE DEI FENOMENI DI INTERAZIONE MICROBICA FATTORI IMPLICITI ESPRESSIONE DEI FENOMENI DI INTERAZIONE MICROBICA NEUTRALISMO MUTUALISMO COMMENSALISMO ANTAGONISMO COMPETIZIONE PARASSITISMO

ESPRESSIONE DELL’AMBIENTE IN CUI SI TROVA L’ALIMENTO (substrato) FATTORI ESTRINSECI ESPRESSIONE DELL’AMBIENTE IN CUI SI TROVA L’ALIMENTO (substrato) TEMPERATURA COMPOSIZIONE DELL’ATMOSFERA

FATTORI INTRINSECI ATTIVITA’ DELL’ACQUA (aw) pH POTENZILE DI OSSIDORIDUZIONE (Eh) CONTENUTO IN NUTRIENTI PRESENZA DI INIBITORI STRUTTURE FISICHE DELL’ALIMENTO

CHE COSA E’ L’ATTIVITA’ DELL’ACQUA Le cellule microbiche non possono vivere in assenza di acqua Substrato: H2O presente --> umidità percentuale H2O utilizzabile o "libera" --> attività dell'H2O = aw aw = p/po p= pressione di vapore del substrato po= pressione di vapore dell'H2O pura alla stessa temperatura

STRUMENTI PER LA MISURA DELL’ATTIVITA’ DELL’ACQUA

per diversi gruppi microbici Valori di aw ottimali per diversi gruppi microbici BATTERI = 0,990-0,995 LIEVITI = 0,870 MUFFE = 0,700

Valori di aw limite per diversi gruppi microbici GRUPPO MICROBICO aw PRODOTTO Batteri normali 0.91 Carne fresca, latte Lieviti normali 0.88 Succhi concentrati Muffe normali 0.80 Marmellate Batteri alofili 0.75 Pesce salato Muffe xerofile 0.65 Farine Lieviti osmofili 0.60 Futta secca Miele

ATTIVITÁ DELL’ACQUA DI ALCUNI ALIMENTI

ATTIVITÁ DELL’ACQUA DI ALCUNI ALIMENTI

COME ABBASSARE L’aw DI UN ALIMENTO RIDUZIONE DEL CONTENUTO DI ACQUA CONCENTRAZIONE ESSICCAZIONE LIOFILIZZAZIONE 2. AUMENTO DEL CONTENUTO DI SOLUTI ZUCCHERAGGIO SALAGIONE

CONCENTRAZIONI DI SACCAROSIO EFFETTO DEL SACCAROSIO SULL’aw DI UNA SOLUZIONE CONCENTRAZIONI DI SACCAROSIO (w/w) aw 4 % 0.990 8 % 0.987 13 % 0.985 24 % 0.976 32 % 0.968 39 % 0.958 45 % 0.947

CONCENTRAZIONI DI NaCl EFFETTO DEL SALE SULL’aw DI UNA SOLUZIONE CONCENTRAZIONI DI NaCl aw 0.9 % 0.995 1.7 % 0.99 3.5 % 0.98 7 % 0.96 10 % 0.94 13 % 0.92 16 % 0.90 19 % 0.88 22 % 0.86

IMPIANTI INDUSTRIALI DI CONCENTRAZIONE

TAMBURI DI ESSICCAZIONE

IMPIANTO PILOTA DI ESSICCAZIONE SPRAY                                                                                MINI SPRAY DRYER

                                ATOMIZZATORI SPRAY DRYER

LIOFILIZZATORE

MECCANISMI DI RESISTENZA A BASSI VALORI DI aw ACCUMULO INTRACELLULARE DI SOLUTI STRATEGIA GENERALE: K+, glutammato, glutammina, prolina, aminobutirrato, alanina, glicina, trealosio, saccarosio, glucosio, glicerolo.

MECCANISMI DI RESISTENZA A BASSI VALORI DI aw ACCUMULO DI PROLINA E ALTRI A.A. SINTETIZZATI EX-NOVO O ASSIMILATI DAL MEZZO ESTERNO (da 166 mM in assenza di NaCl a 716 mM al 7.5% di NaCl). SINTESI E ACCUMULO DI TREALOSIO. ACCUMULO DI ALCOLI POLIVALENTI (es. glicerolo).

FATTORI INTRINSECI ATTIVITA’ DELL’ACQUA (aw) pH POTENZILE DI OSSIDORIDUZIONE (Eh) CONTENUTO IN NUTRIENTI PRESENZA DI INIBITORI STRUTTURE FISICHE DELL’ALIMENTO

DEFINIZIONE DI pH IL pH È IL LOGARITMO NEGATIVO DELLA CONCENTRAZIONE IDROGENIONICA pH 7.0 rappresenta una concentrazione di ioni H+ pari a 10-7 M = neutralità pH<7.0 = acidità pH>7.0 = alcalinità

TIPI DI SONDE PER MISURA DI pH Punta a sfera: è consigliata per gli usi generali in soluzioni acquose o comunque liquide. L'estremità a sfera consente di avere un'ampia superficie di contatto con il campione di misura. Punta piatta: ideale per superfici, per misure dirette su cute, pelli, carta, etc. Punta conica: molto adatta per misure in prodotti semisolidi, emulsioni, formaggi, carni ed alimenti in genere.

pH APPROSSIMATIVO DI ALCUNE VERDURE E FRUTTI FRESCHI

pH APPROSSIMATIVO DI CARNE E PESCE

ALIMENTI IL CUI pH E’ DOVUTO A PROCESSI DI FERMENTAZIONE FORMAGGI SALAMI OLIVE VERDI YOGURT CRAUTI CETRIOLINI PANE

POTERE TAMPONE DEGLI ALIMENTI I PRODOTTI CARNEI TAMPONANO MEGLIO VARIAZIONI DI pH, RISPETTO AI PRODOTTI VEGETALI, GRAZIE AL CONTENUTO IN PROTEINE.

INTERVALLI DI pH DI CRESCITA APPROSSIMATIVI PER GRUPPI MICROBICI 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Muffe Lieviti Batteri Lieviti e Muffe pH OTTIMALI Batteri

ESSI DIPENDONO ANCHE DAGLI ALTRI FATTORI AMBIENTALI I VALORI DI pH MINIMI, OTTIMALI E MASSIMI PER LA CRESCITA DEI MICRORGANISMI SONO ASSOLUTI? NO ESSI DIPENDONO ANCHE DAGLI ALTRI FATTORI AMBIENTALI E DAL TIPO DI ACIDO

Valori di pH min., max. e optimum per lo sviluppo di alcuni microrganismi

EFFETTO DEL pH NON OTTIMALE SULLE CELLULE MICROBICHE 1 FUNZIONALITÁ DEGLI ENZIMI 2 DISPONIBILITÀ E TRASPORTO DEI NUTRIENTI

FATTORI INTRINSECI ATTIVITA’ DELL’ACQUA (aw) pH POTENZILE DI OSSIDORIDUZIONE (Eh) CONTENUTO IN NUTRIENTI PRESENZA DI INIBITORI STRUTTURE FISICHE DELL’ALIMENTO

DEFINIZIONE DI POTENZIALE DI OSSIDO-RIDUZIONE IL POTENZIALE DI OSSIDO-RIDUZIONE (Eh) PUÒ ESSERE DEFINITO COME LA TENDENZA DI UN SUBSTRATO A CEDERE O ACQUISIRE ELETTRONI; ESSO SI MISURA IN mV.

PARI CONCENTRAZIONE DI AGENTI OSSIDANTI E RIDUCENTI VALORI DELL’Eh PUÓ ASSUMERE VALORI POSITIVI: max 816 SUBSTRATI OSSIDATI PUÓ ASSUMERE VALORI NEGATIVI: min -421 SUBSTRATI RIDOTTI PUÓ ESSERE UGUALE A ZERO: PARI CONCENTRAZIONE DI AGENTI OSSIDANTI E RIDUCENTI

REAZIONE DI OSSIDAZIONE REAZIONE DI RIDUZIONE A + e- A RIDOTTO OSSIDATO REAZIONE DI OSSIDAZIONE A A + e- RIDOTTO OSSIDATO

REAZIONE DI OSSIDO-RIDUZIONE IL SUBSTRATO CHE CEDE ELETTRONI SI OSSIDA, MENTRE IL SUBSTRATO CHE ACQUISTA ELETTRONI SI RIDUCE. A + B C + D ossidato ridotto ridotto ossidato

AGENTI RIDUCENTI E OSSIDANTI SOSTANZE CHE CEDONO FACILMENTE ELETTRONI (ANTIOSSIDANTI) AGENTI OSSIDANTI SOSTANZE CHE ACQUISISCONO FACILMENTE ELETTRONI

UNA REAZIONE DI OSSIDO-RIDUZIONE PUÒ AVVENIRE PER REAZIONE CON L’OSSIGENO 2A + O2 2AO

ANTIOSSIDANTI USATI NEGLI ALIMENTI

CHE COSA INFLUENZA L’Eh DEGLI ALIMENTI?

INFLUENZA DELL’ATMOSFERA ESTERNA SULL’Eh DEGLI ALIMENTI ALIMENTO H2O O2 CO2

PROCESSI DI TRASFORMAZIONE CHE INFLUENZANO L’Eh DEGLI ALIMENTI MACINAZIONE OMOGENEIZZAZIONE TRATTAMENTI TERMICI ……...

INFLUENZA DELLA CRESCITA MICROBICA SULL’Eh DEGLI ALIMENTI METABOLISMO MICROBICO Eh positivo Eh negativo

COMPONENTI CHIMICI CHE STABILIZZANO L’Eh DEGLI ALIMENTI NELLE CARNI: GRUPPI SH IN FRUTTA E VEGETALI: ACIDO ASCORBICO E ZUCCHERI RIDUCENTI

FATTORI CHE INFLUENZANO L’Eh DEGLI ALIMENTI L’Eh DEGLI ALIMENTI DIPENDE DA: tensione di ossigeno dell’atmosfera circostante; grado di accesso dell’atmosfera; processi di trasformazione; metabolismo microbico; capacità di resistere a cambiamenti di Eh.

Eh INDICATIVO DI ALCUNE CATEGORIE DI ALIMENTI VALORI POSITIVI: SUBSTRATI OSSIDATI VALORI NEGATIVI: SUBSTRATI RIDOTTI

CLASSIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI IN BASE ALLE ESIGENZE NEI CONFRONTI DELL’Eh E DELL’OSSIGENO Microrganismi anaerobi: Eh di circa -200 mV (prediligono substrati ridotti) Microrganismi aerobi: Eh + (prediligono substrati ossidati) Microrganismi anaerobi facoltativi: Eh indifferenti Microrganismi microaerofili: Eh + ma con poco O2

ESEMPI DI MICRORGANISMI: AEROBI MUFFE, MOLTI MICROCOCCHI, BACILLUS ANAEROBI OBBLIGATI OSSIGENOTOLLERANTI CLOSTRIDI, BATTERI PROPIONICI BATTERI LATTICI ANAEROBI FACOLTATIVI LIEVITI, MOLTI STAFILOCOCCHI MICROAEROFILI ALCUNI LATTOBACILLI

FATTORI INTRINSECI ATTIVITA’ DELL’ACQUA (aw) pH POTENZILE DI OSSIDORIDUZIONE (Eh) CONTENUTO IN NUTRIENTI PRESENZA DI INIBITORI STRUTTURE FISICHE DELL’ALIMENTO

ESIGENZE NUTRITIVE DEI MICRORGANISMI ALIMENTARI ACQUA FONTE DI ENERGIA SORGENTE DI AZOTO VITAMINE E FATTORI DI CRESCITA SALI MINERALI

NUTRIENTI DEI MICRORGANISMI ALIMENTARI SORGENTI DI ENERGIA: ZUCCHERI, ALCOLI, AMMINOACIDI, CARBOIDRATI COMPLESSI, GRASSI. SORGENTI DI AZOTO: AMMINOACIDI, PEPTIDI, PROTEINE, ACIDI NUCLEICI. VITAMINE FATTORI DI CRESCITA: Vitamina B, biotina, acido pantotenico, piridossina…

I PRINCIPALI GRUPPI MICROBICI IN RELAZIONE ALLE ESIGENZE NUTRITIVE BATTERI GRAM + BATEERI GRAM - LIEVITI MUFFE

FATTORI INTRINSECI ATTIVITA’ DELL’ACQUA (aw) pH POTENZILE DI OSSIDORIDUZIONE (Eh) CONTENUTO IN NUTRIENTI STRUTTURE FISICHE DELL’ALIMENTO PRESENZA DI INIBITORI

COSTITUENTI ANTIMICROBICI INTRINSECI DEGLI ALIMENTI COMPOSTI O COMPLESSI DI COMPOSTI, TIPICI DI CERTI ALIMENTI, CHE MOSTRANO UNA PIÙ O MENO INTENSA ATTIVITÀ ANTIMICROBICA.

SPEZIE AD ATTIVITÀ ANTIMICROBICA Rosmarino Salvia Origano Timo Noce moscata Chiodi di garofano Pepe Alloro Cannella

ALCUNI ANTIMICROBICI NEGLI ALIMENTI Eugenolo Allicina Aldeide cinnamica Isotiocianato di allile Timolo Isotimolo (carvacrolo) Lattoferrina Conglutinina Sistema lattoperossidasico Lisozima Conalbumina Ovotransferrina Acido idrossicinnamico e derivati: p-cumarico, ferulico, caffeico, clorogenico.

NEL MOSTO E NEL VINO? ANIDRIDE SOLFOROSA LISOZIMA BOTRITICINE ACIDI GRASSI A CATENA CORTA ETANOLO CHITOSANO ACIDO SORBICO

ESPRESSIONE DELL’AMBIENTE IN CUI SI TROVA L’ALIMENTO FATTORI ESTRINSECI ESPRESSIONE DELL’AMBIENTE IN CUI SI TROVA L’ALIMENTO TEMPERATURA COMPOSIZIONE DELL’ATMOSFERA

CLASSIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI IN BASE ALLE TEMPERATURE DI CRESCITA PSICROFILI HANNO UN OPTIMUM TRA 4-7°C MESOFILI CRESCONO BENE TRA 20 E 45°C, HANNO UN OPTIMUM TRA 30 E 40°C MESOFILI PSICROTROFICI CRESCONO BENE TRA 4 E 10°C, HANNO UN OPTIMUM TRA 30 E 40°C TERMOFILI CRESCONO BENE A OLTRE 45°C, HANNO UN OPTIMUM TRA 45 E 65°C

ESEMPI DI BATTERI PSICROTROFICI, MESOFILI E TERMOFILI PSEUDOMONAS, ALCUNE SPECIE DI MICROCOCCHI MESOFILI LATTOCOCCHI, ENTEROCOCCHI, STAFILOCOCCHI, MOLTI MICROCOCCHI, LATTOBACILLI MESOFILI, LIEVITI TERMOFILI STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS, LATTOBACILLI TERMOFILI

ESPRESSIONE DEI FENOMENI DI INTERAZIONE MICROBICA FATTORI IMPLICITI ESPRESSIONE DEI FENOMENI DI INTERAZIONE MICROBICA MUTUALISMO COMMENSALISMO ANTAGONISMO COMPETIZIONE PARASSITISMO PREDAZIONE ANTAGONISMO

MUTUALISMO E COMMENSALISMO PRESENZA DI AEROBI E ANAEROBI BATTERI DELLO YOGURT PRESENZA DI BATTERI E LIEVITI (FML) ……...

COMPETIZIONE COMPETIZIONE DA SUBSTRATO

ANTAGONISMO ANTIBIOTICI PEROSSIDO DI IDROGENO ACIDI ORGANICI (a catena corta) ABBASSAMENTO DEL pH BATTERIOCINE/Tossina Killer DIACETILE

ESEMPI DI ANTIBIOTICI DI ORIGINE MICROBICA

DEFINIZIONE DI BATTERIOCINE Proteine biologicamente attive, generalmente di piccole dimensioni, sintetizzate ribosomalmente ed eventualmente modificate post-traduzionalmente o complessi proteici in grado di esercitare attività battericida nei confronti di altre specie batteriche, ma non sul microrganismo produttore.

BATTERIOCINE PRODOTTE DA BATTERI LATTICI

EVIDENZIAZIONE DI ATTIVITÁ BATTERIOCINOGENA Strato del ceppo sensibile Zone di inibizione Ceppi produttori Disattivazione enzimatica dell’attività inibente

Il fattore KILLER Certi ceppi di lievito (detti K) producono tossine di natura proteica in grado di inibire altri ceppi (detti S). Il ceppo K è insensibile alla sua tossina, ma può essere inibito da una tossina K di un’altro ceppo. Inoltre, esistono ceppi (detti N) che sono resistenti pur non producendo tossine

LA CRESCITA DEI MICRORGANISMI NEGLI ALIMENTI PUÓ ESSERE CONTROLLATA MEDIANTE: TEMPERATURA (alta o bassa) CONSERVANTI CHIMICI AFFUMICAMENTO ESSICCAZIONE ATMOSFERA MODIFICATA RADIAZIONI ALTE PRESSIONI CAMPI ELETTRICI

Sterilizzazione Per sterilizzazione si intende l'eliminazione o l'uccisione di tutte le forme viventi presenti La sterilità assoluta non esiste Le procedure e le condizioni da adottare nella sterilizzazione dipendono dalla forma e dal numero di microrganismi presenti, nonché dal materiale da sterilizzare Le forme viventi più resistenti --> endospore batteriche Mezzi di sterilizzazione Fisici: riscaldamento, radiazioni, filtrazione Chimici: impiego di sostanze ad attività antimicrobica

Sterilizzazione mediante riscaldamento Esposizione del materiale ad alte temperature --> denaturazione delle proteine 1) sterilizzazione alla fiamma usata per anse aghi, pinze, bacchette di vetro 2) sterilizzazione con calore secco - Il materiale da sterilizzare viene posto in stufe e quindi riscaldato con aria calda (bassa conducibilità termica) - usata per la sterilizzazione di vetreria da laboratorio: 160-180 °C 2h - non può essere usata per materiali che possono essere alterati ad alte temperature (gomma, plastica, carta) - bisogna aspettare che il materia si raffreddi (contaminazione e rottura) indicatori di steriliz. (polvere di solfonamide, fonde a 163 °C) 3) sterilizzazione con calore umido - molto efficace, viene impiegata per sterilizzare terreni di coltura e liquidi in genere - vapore sotto pressione o vapore fluente (autoclave) - il vapore saturo sotto pressione permette di raggiungere temperature elevate ed uniformi - espulsione di tutta l'aria dall'autoclave - vapore ad 1 Atm (oltre quella ambientale) ---> 121 °C - sterilizzazione in autoclave: generalmente 110-120 °C per 20-60' - sterilizzazione a vapore fluente, si lascia la valvola di scarico aperta, la temperatura è di circa 100 °C, il tempo di sterilizzazione 30-60' - usata per sterilizzare soluzioni di sostanze termolabili (aminoacidi, vitamine, zuccheri)

4) sterilizzazione continua - per sterilizzare grandi masse di terreno - tempo di riscaldamento, sterilizzazione, raffreddamento - prolungata esposizione al calore distruzione dei fattori di crescita caramellizzazione degli zuccheri polimerizzazione di aldeidi reazione di Maillard (zuccheri ed aminoacidi) - alte temperature per tempi molto brevi - sistema tubulare o a piastre nel quale il terreno viene rapidamente riscaldato (135-160 °C) ed in seguito subito raffreddato esposizione del terreno a vapore surriscaldato per tempi brevi 5) Tindalizzazione o sterilizzazione frazionata - ripetuti cicli di riscaldamento (100 °C) e raffreddamento - in alcuni substrati permette la germinazione delle spore è raccomandata per materiali alterabili a temp. > di 100 °C 6) Pasteurizzazione - elimina solo le forme vegetative - si impiegano temperature di 60-65 °C - ideata da Pasteur per il vino e la birra - impiegata per la conservazione degli alimenti poiché non altera troppo le loro caratteristiche es. latte 62 °C per 30 min

Sterilizzazione mediante filtrazione Sterilizzazione mediante radiazioni Raggi UV: -massimo effetto germicida a 260 nm (bersaglio DNA) - posseggono basse capacità di penetrazione - lampade germicide, emettono luce a 258 nm - sterilizzazione di superfici e di ambienti Raggi X (10-1-10 nm) e Raggi gamma (10-3-10-1 nm) - agenti sterilizzanti poco usati data la loro pericolosità posseggono notevoli capacità di penetrazione Sterilizzazione mediante filtrazione - rimozione dei microrganismi dalla massa - applicata principalmente a soluzioni di sostanze termolabili - la soluzione da sterilizzare viene fatta passare attraverso filtri capaci di trattenere i microrganismi (diametro < di 100 mm) - Filtri di porcellana (candela Chamberlad) - Filtri di farina fossile (filtro Berkefeld) - Filtri di amianto (filtro Seitz) - Membrane di nitrocellulosa (0.22- 0.45 mm)

Sterilizzazione chimica Diverse sostanze chimiche (Antisettici) vengono usate come agenti sterilizzanti Disinfezione (riduzione del n° di microrg., eliminazione di alcune forme) Sostanza: battericida, fungicida, viricida, attività sporicida Non è sempre applicabile Criteri di scelta del composto da impiegare efficacia, l'azione antimicrobica deve avvenire in breve tempo il composto non deve portare alterazioni al materiale trattato la presenza del disinfettante non deve interferire con l'uso del materiale il composto deve essere atossico per l'uomo egli animali Per la sterilizzazione di terreni di coltura: b-propionolattone --> acido b-idrossipropionico Sterilizzazione di ambienti e materiale plastico --> ossido di etilene Meccanismo di azione e ceppi resistenti