SPORE Alcuni bacilli Gram+ aerobi ed anaerobi obbligati (rispettivamente Bacillus e Clostridium) in determinate condizioni ambientali, quando la crescita cellulare si blocca a causa dell’esaurimento delle sostanze nutritive, danno origine a spore. Le spore sono forme di resistenza che consentono al batterio di sopravvivere in un ambiente sfavorevole. Hanno un elevato grado di resistenza al calore e sono inoltre resistenti ad altri agenti chimici e fisici, quali la disidratazione, le radiazioni, gli acidi ed i disinfettanti chimici Spore del ClostridiumTetani

Nella cellula che inizia il processo di sporulazione avvengono numerosi cambiamenti controllati a livello genetico, e l’intero processo può essere considerato un caso di differenziamento cellulare. La struttura di una spora è molto più complessa da quella della cellula vegetativa poiché è costituita da numerosi strati di rivestimento. Lo strato più esterno, detto esosporio, rappresenta uno strato di rivestimento sottile e delicato. All’interno dell’esosporio si trova la tunica (o parete della spora) che è composta da uno o più strati proteici. Al di sotto di questa si trova la corteccia (o cortex), costituita da uno strato peptidoglicanico lasso, all’interno del quale si trova il “core” costituito da strutture convenzionali, quali parete cellulare, membrana citoplasmatica, nucleoide ecc.. La spora, in adatte condizioni ambientali, da uno stato di criptobiosi, è capace di generare una cellula vegetativa anche dopo molti anni.

Disinfezione e Sterilizzazione Qualsiasi procedimento che si prefigga la uccisione di microrganismi patogeni presenti nell’ambiente (=eliminazione degli agenti capaci di causare infezione o malattia). STERILIZZAZIONE Qualsiasi procedimento che si prefigga la distruzione di tutti i microrganismi (patogeni e non) presenti in un determinato materiale (= eliminazione di tutte le forme viventi, siano esse animali o vegetali, macroscopiche, microscopiche o submicroscopiche, innocue o nocive).

La sterilizzazione può essere ottenuta mediante: - Calore (incenerimento, vapore sotto pressione, calore secco) - Radiazioni ( UV, radiazioni ionizzanti) - Sostanze chimiche (Ossido di etilene) - Filtrazione

Calore Incenerimento: sulla fiamma o in bruciatori efficacia = ottima impieghi = molto limitati - strumenti di laboratorio metallici (anse, aghi) - distruzione di tessuti, materiale cartaceo o carogne di animali

Vapore sotto pressione (autoclave) alla pressione di 1 atm. il vapore raggiunge una T di 121 °C alla quale le più resistenti spore batteriche vengono distrutte in 5-10 min. efficacia = ottima impieghi = oggetti in gomma, garze, terreni di coltura in brodo o agarizzati, purché privi di sostanze deperibili alle alte temperature (es. siero). Tempi di sterilizzazione a diverse T in autoclave Temperatura (°C) Pressione( atm) Tempo(min) 112 +0,5 30 121 +1 15 134 +2 10

Calore secco (stufe) richiede tempi e T > rispetto all'autoclave, non essendo l'aria un buon conduttore del calore. efficacia = ottima impieghi = vetreria, materiali anidri che possono essere alterati dal contatto col vapore Tempi di sterilizzazione a diverse T in stufa a secco Temperatura(°C) Tempo( min) 140 180 150 160 120 170 60

Radiazioni UV Lampade germicide: azione germicida legata alla capacità dei raggi UV di determinare rotture e mutazioni negli acidi nucleici (soprattutto DNA). efficacia = ottima ma limitata alle superfici esposte (radiazioni non penetranti) impieghi = potabilizzazione dell'acqua, sterilizzazione dell'aria e delle superfici (laboratori, sale operatorie) Radiazioni ionizzanti (raggi gamma): determinano rotture e mutazioni negli acidi nucleici sia direttamente che attraverso radicali dell'O che si producono dalla scissione dell'acqua. efficacia = ottima (radiazioni penetranti) ma costo elevato impieghi = derrate alimentari, strumentario in plastica (siringhe, cateteri, piastre, pipette

Ossido di etilene: molto attivo contro microrganismi e spore. Sostanze chimiche Ossido di etilene: molto attivo contro microrganismi e spore. Meccanismo d'azione: alterazione dei gruppi attivi, COOH, NH2, SH2, OH, con blocco delle attività enzimatiche. efficacia = ottima (notevole capacità di penetrazione). impieghi = strumenti medici o chirurgici che non sopportano l'esposizione ad elevate temperature (Es. endoscopi). Poiché questo gas é molto irritante, é necessario favorirne l'allontanamento prima di utilizzare il materiale trattato. Ciò avviene spontaneamente dopo un sufficiente periodo di conservazione (1-15 gg), questi tempi possono essere ridotti in camere a ventilazione forzata.

Filtrazione Filtri con pori di diametro inferiore a quello dei più piccoli batteri. [ I virus per le loro piccole dimensioni passano attraverso i filtri sterilizzanti ] . Possono avere diversa natura: porcellana porosa Chamberland (diametro = 1 micron) amianto Seitz cellulosa Millipore (diametro = 0,22 micron) polimeri sintetici Sartorius (diametro = 0,22 micron)

La disinfezione può essere ottenuta mediante: agenti fisici: calore: a temperature più basse e per tempi inferiori rispetto a quelli necessari per la sterilizzazione. agenti chimici: -ossidanti diretti: acqua ossigenata -alogeni: cloro, iodio -alcoli: etilico, isopropilico -aldeidi: formica, glutarica -fenoli -saponi -detergenti sintetici -clorexidina

MECCANISMI dei DISINFETTANTI Denaturazione delle proteine (formaldeide, glutaraldeide, ossido di etilene, propriolattone) Ossidazione di enzimi (perossidi, permanganati, cloro, ipocloriti, iodio) Alterazione delle membrane (alcooli, fenoli, composti dell’ammonio quaternario, clorexidina)

ppm = parti per milione

FARMACI ANTIBATTERICI Antibiotico è un composto ad uso terapeutico che esercita un’azione letale nei confronti dei microrganismi. Uno dei requisiti fondamentali perché un antibatterico possa essere impiegato sull’uomo è la tossicità selettiva: esso cioè deve danneggiare le cellule del microrganismo parassita, ma risultare relativamente innocuo per quelle dell’ospite( caratteristica fondamentale che differenzia i chemioantibiotici dai disinfettanti). La tossicità selettiva trova il suo presupposto in alcune caratteristiche strutturali o funzionali, che differenziano selettivamente il microrganismo dall’ospite. Si può così comprendere perché, ad esempio, le penicilline e le cefalosporine che impediscono la formazione normale della parete batterica, una struttura presente solo nelle cellule batteriche ed assente in quelle animali, presentano una tossicità trascurabile; o perché una limitatissima sia esplicata dalla rifampicina, che inibisce selettivamente la RNA-polimerasi batterica, non interferendo invece con quella delle cellule eucariote.

ATTIVITA’ ANTIBATTERICA -1 Una caratteristica che accomuna tutti i farmaci antibatterici è rappresentata dal fatto che essi agiscono inibendo una determinata via metabolica essenziale per il batterio, per cui sono attivi solo nei confronti dei batteri attivamente metabolizzanti, differenziandosi così dai disinfettanti che agiscono denaturando alcuni componenti strutturali della cellula batterica e sono pertanto attivi nei confronti dei batteri, indipendentemente dalla loro situazione metabolica. Dal punto di vista pratico i farmaci antibatterici possono essere divisi in due categorie batteriostatici: agiscono primitivamente arrestando la moltiplicazione batterica; - battericidi: agiscono uccidendo i batteri. Oggi questa suddivisione non appare più molto rigida: vi sono ad esempio farmaci che si comportano da batteriostatici a basse concentrazioni, ma che sono battericidi a concentrazioni più elevate ( come ad esempio i macrolidi e il linezolid)

ATTIVITA’ ANTIBATTERICA -2 La distinzione in realtà non è netta in quanto anche i farmaci batteriostatici, a concentrazioni elevate o dopo un tempo di contatto molto lungo, finiscono con l’uccidere il batterio. In pratica i farmaci batteriostatici sono identificati da un periodo iniziale della loro azione, caratterizzato dalla reversibilità dell'azione antibatterica in seguito a rimozione del farmaco. Agli effetti terapeutici comunque, sia i farmaci batteriostatici sia quelli battericidi sono ugualmente efficaci, in quanto anche un batterio impedito nella replicazione, e non solo un batterio ucciso, è facilmente eliminato dalle difese dell'organismo.

Classificazione Batteriostatici Battericidi Cloramfenicolo Clindamicina Eritromicina Linezolid Nitrofurantoina Sulfamidici Tetracicline Trimetoprim Oggi questa suddivisione non appare più molto rigida: vi sono ad esempio farmaci che si comportano da batteriostatici a basse concentrazioni, ma che sono battericidi a concentrazioni più elevate ( come ad esempio i macrolidi e il linezolid) Battericidi Aminoglicosidi Bacitracina Carbapenemi Cefalosporine Chinoloni Colistina Penicilline Polimixina Vancomicina Antibiotici tempo-dipendenti e antibiotici dose-dipendenti I farmaci battericidi sono ulteriormente divisi in base alla velocità d’azione: farmaci rapidamente battericidi (o concentrazione-dipendenti): per esempio AMINOGLICOSIDI FLUOROCHINOLONI farmaci battericidi lenti (o tempo-dipendenti): per esempio BETALATTAMINE

PRINCIPALI MECCANISMI D’AZIONE 1) Inibizione della sintesi della parete cellulare 2) Alterazione della permeabilita’ della membrana cellulare o del trasporto attraverso la parete cellulare 3) Inibizione della sintesi proteica 4) Inibizione della sintesi di acidi nucleici 5) Metabolismo

INIBITORI DELLA SINTESI DELLA PARETE CELLULARE (Penicilline, Cefalosporine, Carbapenemici, Monobattamici) INIBITORI DELLA SINTESI DELLA PARETE CELLULARE (Penicilline, Cefalosporine, Carbapenemici, Monobattamici) Gli antibiotici beta–lattamici devono il loro nome all’anello che caratterizza il nucleo centrale di queste molecole. Il farmaco si lega a recettori cellulari detti PBP (proteine leganti la penicillina),presenti sulla cellula batterica, blocca la reazione di transpeptidazione e la sintesi del peptidoglicano. Beta-lattamici

INIBITORI DELLA SINTESI PROTEICA (Tetracicline, Aminoglicosidi, Cloramfenicolo, Macrolidi) Questi farmaci interferiscono con la sintesi proteica, interagendo con le subunità ribosomiali, selettivamente, poiché i ribosomi batterici sono diversi dai ribosomi delle cellule eucariotiche. Le tetracicline sono batteriostatici e si legano alla subunità 30 S. Gli aminoglicosidi sono battericidi, non agiscono sugli anaerobi, si legano alla subunità 30 S. Il cloramfenicolo ha azione batteriostatica, agisce sulla subunità 50S, Anche i macrolidi agiscono sulla subunità 50 S, hanno una struttura ad anello, sono batteriostatici INIBITORI DELLA TRASCRIZIONE (RNA) Le rifampicine si legano alla subunità beta della RNA-polimerasi batterica rendendola inattiva, inibendo così la sintesi di RNA batterico in modo selettivo. Sono molto attive nei confronti dei micobatteri, per questo si cerca di limitarne l’uso verso altri batteri.

INIBITORI DELLA SINTESI DI DNA I chinolonici inibiscono la DNA girasi, che regola la conformazione del DNA batterico. Sono poco attivi nei confronti dei Gram-positivi. Per questo alla loro molecola base è stato aggiunto il fluoro. I fluorochinolonici sono battericidi. FUNZIONALITA’ DI MEMBRANA Le polimixine sono formate da polipeptidi ciclici. Sono attive solo sui Gram-negativi, si legano alla membrana esterna e ne distruggono la capacità osmotica, provocando la fuoriuscita dei metaboliti. Sono tossiche anche per le cellule eucariotiche. METABOLISMO I sulfamidici sono fra i più antichi chemioterapici . Contrastano la sintesi degli acidi folici ad opera dei batteri (le cellule eucariotiche sono in grado di utilizzare solo gli acidi folici preformati presenti nella dieta), competendo con l’acido p-aminobenzoico nei confronti dell’enzima che ne catalizza l’inserimento nella molecola.

RESISTENZA

INATTIVAZIONE DELL’ANTIBIOTICO: E’ stato il primo meccanismo di resistenza ad essere identificato: già nel 1940, fu identificato un enzima in grado di distruggere irreversibilmente l’anello betalattamico della penicillina G, facendo perdere all’antibiotico la sua attività. Questo enzima fu chiamato PENICILLINASI. Successivamente, si identificarono altri enzimi in grado di aprire l’anello betalattamico delle penicilline e delle cefalosporine. Questi enzimi vennero chiamati BETALATTAMASI.

( diminuito ingresso dell’antibiotico nella cellula ) ( aumentata uscita dell’antibiotico ) ( che alterano o distruggono l’antibiotico ) ( alterazione del bersaglio, che ne diminuisce l’affinità per l’antibiotico)

L'antibiogramma: premesse teoriche Lo scopo (e la pretesa) principale dell'antibiogramma è quello di predire il risultato clinico di un trattamento antimicrobico con il farmaco saggiato. Si basa sulla presunzione che la misura in vitro dell’attività dei farmaci antimicrobici sui batteri isolati dalla sede dell’infezione si possa valutare in condizioni che simulano quelle che ci sono in vivo.

Con trattamenti a dosi raccomandate : Sensibili sono definiti quei microrganismi il cui sviluppo è inibito dalle concentrazioni sistemiche raggiungibili dal farmaco antimicrobico somministrato alle previste posologie [ il risultato “sensibile” implica che c’è un’alta probabilità che il paziente risponda alla terapia] Resistenti si definiscono quei microrganismi che non sono inibiti dalle usuali concentrazioni sistemiche raggiungibili dal farmaco somministrato alle previste posologie [ il risultato “resistente” implica che il trattamento molto probabilmente fallirà] Il risultato Intermedio definisce quei microrganismi che possono essere trattati con quell'antibiotico a un dosaggio piu' alto dell’usuale. In questo caso l'antibiotico si puo' usare   nel trattamento di infezioni di quei distretti dove si raggiungono concentrazioni più elevate (come ad esempio nell'urina) o quando un alto dosaggio puo' essere utilizzato senza che si raggiungano livelli tossici

ANTIBIOGRAMMA Antibiogramma: è la metodica utilizzata per saggiare la sensibilità dei microrganismi nei confronti dei chemioantibiotici La dimostrazione che esiste una relazione lineare tra la MIC (la più bassa concentrazione di antibiotico capace di inibire la crescita di un microrganismo) di un farmaco e l’alone di inibizione della crescita in piastre di agar, operata da un dischetto di carta imbevuto di un’adeguata concentrazione del farmaco, ha consentito la messa a punto della tecnica dell’antibiogramma. Da una coltura pura del ceppo in esame, si prepara una sospensione batterica di appropriata densità e si semina una piastra di Mueller- Hinton agar; quando si asciuga, si posano i dischetti contenenti i vari antibiotici da testare. Dopo incubazione di 18 ore si misura l’eventuale alone di inibizione. Su tabelle edite da Organismi internazionali, quali CLSI( Clinical and Laboratory Standards Institute )o EUCAST( European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) si avrà il riscontro sulla sensibilità.

TECNICHE DI LABORATORIO