L’analisi di mutazioni di RET in Endocrinologia Prima di tutto vorrei ringraziare il Prof Carani e la Prof.ssa Simoni per il gentile invito a questo incontro, reso possibile anche grazie alla sollecitudine della D.ssa Pugni che ha coordinato i nostri reciproci sforzi per organizzare questo seminario

Long arm of chromosome 10 (10q11.2) RET mutations in Endocrinology RET (REarranged during Transfection) protooncogene Long arm of chromosome 10 (10q11.2) susceptibility gene for Vorrei dedicare questo nostro tempo insieme a due principali argomenti, ossia l’utilità dell’analisi di mutazioni di RET in Endocrinologia e alcuni flash sulle nuove acquisizioni in merito alla patogenesi delle neoplasie tiroidee. RET, così denominato poiché identificato come gene riarrangiato durante i processi di trasfezione, è un proto-oncogene, ossia un gene che, se mutato, provoca la comparsa di neoplasie. Il gene si trova sul braccio lungo del cromosoma 10 in posizione 10q11.2 ed è considerato il gene le cui mutazioni sono responsabili della comparsa del MTC familiare associato a feocromocitoma ed iperparatiroidismo, ossia della MEN2 familial medullary thyroid cancer (FMTC) pheochromocytoma parathyroid hyperplasia/adenomas multiple endocrine neoplasia type 2 (MEN 2)

RET mutations in Endocrinology RET  transmembrane receptor extracellular domain transmembrane domain Il gene RET fisiologicamente codifica per una proteina che è un recettore transmembrana, costituito da un dominio extracellulare, uno transmembrana di ancoraggio alla membrana plasmatica ed uno intracellulare dotato di dominio catalitico tirosin chinasico. tyrosine kinase domain

RET mutations in Endocrinology RET dimerizes associates with GFR -1 forms the GDNF receptor (glial cell line–derived neurotrophic factor recepor, GDNF R) Si tratta infatti di un recettore tirosin chinasico che si associa ad un altro recettore di membrana, detto GFR, a formare il recettore per il fattore neurotrofico per le cellule di derivazione gliale, ossia il GNDF receptor. In assenza del ligando il sistema non funziona. In the absence of GDNF, RET and GFR-1 do not dimerize

RET mutations in Endocrinology Al contrario, in presenza del ligando, RET dimerizza, si autofosforila ed attiva la via di trasduzione a valle In the presence of GDNF the receptor complex is activated autofosforilation signal transduction pathway activation

RET mutations in Endocrinology La dimerizzazione del recettore infatti porta in stretta prossimità i domini catalitici tirosin chinasici dei due emirecettori, che si fosforilano a vicenda in presenza di ATP, determinando anche la fosforilazione in residui di tirosina delle molecole di trasduzione del segnale a valle, che generano un segnale mitogenico Machens et al. 2009 J Intern Med 266: 114

RET mutations in Endocrinology A valle di RET, infatti, vengono attivate le vie di PI3 kinase e della MAPK chinasi, oltre probabilmente ad altre via ancora sconosciute, il cui effetto finale è la stimolazione della proliferazione cellulare.

RET mutations in Endocrinology RET is expressed in several normal tissues RET è fisiologicamente espresso in molti organi e tessuti sia normali che neoplastici,

RET mutations in Endocrinology RET is expressed in several normal and neoplastic tissues Come riportato in varie banche dati.

cell hyperstimulation RET mutations in Endocrinology RET mutations constitutive supraphysiological activation of the RET receptor tyrosine kinase cell hyperstimulation Al contrario, le mutazioni di RET comportano la trasdormazione neoplastica soltanto in alcuni tipi cellulari, quali le cellule C parafollicolari, le cellule cromaffini della midollare del surrene e le cellule principali paratiroidee. Tali mutazioni sono rappresentate da mutazioni puntiformi (single nucleoide polymorphism, SNP) che sono di tipo attivante, per cui l’attività tirosin chinasi del recettore è costitutivamente funzionante indipendentemente dalla presenza del ligando fisiologico thyroid C cells adrenal medullary cells parathyroid chief cells

RET mutations in Endocrinology ‘Gain-of-function’ mutations Least high transforming ability transmembrane domain codon 649 RET protein monomers are kept in close proximity to each other through noncovalent receptor–receptor interactions Le mutazioni di RET sono quindi attivanti, ma le diverse mutazioni hanno impatto differente sulla funzione della chimasi. Le mutazioni con minor potere trasformante riguardano il codone 649, nel dominio tranmembrana, che causano interazioni non covelenti fra gli emirecettori, che quindi si trovano molto vicini gli uni agli altri e quindi si attivano facilmente. Machens et al. 2009 J Intern Med 266: 114

cysteine-rich extracellular domains RET mutations in Endocrinology ‘Gain-of-function’ mutations cysteine-rich extracellular domains codons 515, 609, 611, 618, 620, 630, 634 High transforming ability ligand-independent dimerization and cross-phosphorylation of mutant RET receptor proteins loss of a cysteine residue irrespective of the amino acid substituting for cysteine Mutazioni che interessano il dominio extracellulare nella regione ricca in cisteine, responsabile della dimerizzazione, hanno invece elevata attività trasformante. Mutazioni che colpiscono i codoni 515, 809, 611, 630, 634 possono infatti causare una dimerizzazione recettoriale indipendentemente dalla presenza del ligando. addition of one more cysteine residue in codons 533, 606 or 631 Machens et al. 2009 J Intern Med 266: 114

RET mutations in Endocrinology Queste mutazioni infatti fanno in modo che i due emirecettori possano transfosforilarsi a vicenda ed attivare le vie di segnale a valle anche in assenza di GDNF Mutations in the Cystein-rich extracellular domain cause RET dimerization and autophosphorylation, independently of the ligand

RET mutations in Endocrinology ‘Gain-of-function’ mutations Very high transforming ability intracellular tyrosine kinase domain codons 768, 790, 791, 804 and 891 facilitate the access of ATP to its binding site preferential binding of intracellular substrate Mutazioni del dominio chinasico intracellulare sono dotate del maggiore effetto trasformante poiché facilitano l’accesso dell’ATP al sito catalitico e, in alcuni casi, facilitano il legame alle molecole di trasduzione del segnale intracellular catalytic core codon 918 Machens et al. 2009 J Intern Med 266: 114

Mutations in the intracellular kinase domain RET mutations in Endocrinology Tali mutazioni determinano l’autofosforilazione del recettore indipendentemente dalla dimerizzazione Mutations in the intracellular kinase domain cause RET autophosphorylation, independently of dimerization and of the ligand

GENOTYPE-PHENOTYPE CORRELATION RET mutations in Endocrinology Conoscere la mutazione è di cruciale importanza, poiché esistono correlazioni fra il genotipo ed il fenotipo clinico della malattia. Nell’MTC sporadico sono più frequenti le mutazioni della cisteina 634 e del dominio chinasico; nella MEN2Amutazioni del dominio extracellulare e nella MEN2b del dominio intracellulare GENOTYPE-PHENOTYPE CORRELATION

RET mutations in Endocrinology MEN2A: MTC, hyperparathyroidism, pheochromocytoma (100% penetrance) MEN2B: MTC, pheochromocytoma, muco-cutaneous neuromas (98% penetrance) FMTC: MTC Ricordiamo che MEN2A associa all’MTC quadri di iperparatiroidismo e feocromocitoma, MEN2B associa MTC a feocromocitoma e neuromi mucocutanei mentra nell’FMTC c’è solo l’MTC

Tali correlazioni genotipo sono ampiamente documentate in letteratura Tali correlazioni genotipo sono ampiamente documentate in letteratura. La mutazione più frequente sembra essere quella che colpisce la cisteina 634

RET mutations in Endocrinology Come documentato anche da ampie casistiche europee Machens et al. 2009 J Intern Med 266: 114

RET mutations in Endocrinology L’analisi genetica deve quindi rivolgersi agli “hot spot” che si trovano negli esoni 8, 11, 13, 14, 15 e 16. Elisei et al. J Clin Endocrinol Metab 2007, 92(12):4725–4729

RET mutations in Endocrinology Machens et al. 2009 J Intern Med 266: 114 Cost-effective identification of affected family members Per tale motivo, l’analisi genetica è divenuta rapidamente uno step importante nella diagnostica dell’MTC in pratica clinica, poiché identifica rapidamente i membri affetti della famiglia, fornendo al medico uno strumento efficace per stabilire l’indicazione alla tiroidectomia profilattica anche nei soggetti mutati che non hanno ancora sviluppato la malattia Gilchrist et al. Clin Genet 2004; 66: 349–53 legal and ethical importance indicating the need for prophylactic thyroidectomy gold standard of care Rosenthal et al Thyroid 2005; 15: 140–5

Elisei R 2008 Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 22: 941–953 RET mutations in Endocrinology Different forms of medullary thyroid cancer 5th-6th decade of life In tal modo, la percentuale di casi familiari, riportata ad offi in percentuali del 25%, è destinata ad aumentare within 3rd decade of life Elisei R 2008 Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 22: 941–953

RET mutations in Endocrinology Hereditary MTC Prospective family screening Germline RET mutations 95% of MEN2A kindreds Hirshprung disease Lichen amyloidosis 88% of FMTC kindreds Le famiglie MEN2A risultano avere mutazioni di RET nel 95% dei casi, percentuale che si riduce all’88% negli FMT, ma che supera il 95% nella MEN2B >95% of MEN 2B kindreds (codon 918) Elisei et al. 2007 J Clin Endocrinol Metab 92:4725-9 Castellone et al. 2008 Endocrinol Metab Clin North Am 37:363-74, viii

RET mutations in Endocrinology Hereditary MTC 6-75% of “sporadic” MTC carry a germline RET mutation Elisei et al. 2007 J Clin Endocrinol Metab 92:4725-9 Wohllk et al. 1996 J Clin Endocrinol Metab 81: 3740-3745 RET genetic testing should be encouraged in all newly diagnosed MTC patients The National Comprehensive Cancer Network Clinical Practice Guidelines in Oncology 2009 Bisogna inoltre tener presente che fino al 75% dei casi ritenuti sporadici alla diagnosi sono in realtà forme familiari, per cui l’analisi genetica andrebbe condotta in TUTTI i pazienti in cui sia stata fatta la diagnosi di MTC, che andrebbero contemporaneamente sottoposti allo screening biochimico per l’iperparatiroidismo ed il feocromocitoma. biochemical screening for MEN2 hyperparathyroidims pheochromocytoma

RET mutations in Endocrinology Genetic screening in proband and in first degree relatives is fundamental High likelihood of developing MTC during lifespan Inoltre, i parenti di primo grado vanno tutti valutati per la presenza di mutazioni di RET, in caso di positività del probando, poiché la presenza di mutazioni di RET determina un’elevata probabilità di sviluppare la malattia e quindi candida il soggetto alla tiroidectomia profilattica consider prophylactic thyroidectomy follow up

How is genetic analysis perfomed? RET mutations in Endocrinology How is genetic analysis perfomed? Patient referral for MTC or family history of MTC History – evaluate family history Clinical examination Informed consent signature Blood withdrawal (no fasting needed) Sample sent to the Lab Ma come si esegue l’analisi genetica? In pazienti con MTC o storia suggestiva per MTC va valutata l’anamnesi familiare e va fatta una visita accurata per rilevare segni e sintomi di MEN2. È necessario che il paziente firmi un consenso informato prima di essere sottoposto al prelievo di sangue intero (anche non a digiuno) che viene raccolto in provette con anticoagulante (EDTA) per essere avviato al laboratorio

RET mutations in Endocrinology amplificazione del DNA GENOMIC DNA DIRECT SEQUENCING denaturation Capillary electrophoresis purification Dal sangue intero viene estratto il DNA genomico, che viene utilizzato in reazioni della polimerasi a catena per amplificare le regioni geniche maggiormente interessate dalle mutazioni. Il DNA amplificato viene poi purificato e utilizzato in una reazione di sequenziamento. Il prodotto di questa reazione, ulteriormente purificato dai reagenti, viene denaturato e caricato su un sequenziatore automatico che esegue un’elettroforesi capillare e registra l’emissione della fluorescenza relativa a ciascun nucleotide, producendo un elettroferogramma DNA isolation purification Sequencing reaction

RET mutations in Endocrinology Electropherogram analysis by a Technicial by the Physicial in charge Comparison with the normal sequence  any SNP? L’elettroferogramma è costituito dalla successione delle fluorescenze corrispondenti a ciascun nucleotide e quindi permette di verificare la sequenza nucleotidica della regione di DNA amplificata, che va confrontata con la sequenza normale, per verificare la presenza di mutazioni puntiformi. A questo punto il medico può fare la diagnosi di presenza o assenza di mutazioni di RET nelle regioni amplificate. DIAGNOSIS

RET mutations in Endocrinology Risk level Risk RET genotype (mutation in codon) 3 Highest 883, 918, 922 2 High 634, 630, 609, 611, 618, 620 1 Least high 768, 790, 791, 804, 891 Gli studi eseguiti in questo ambito hanno permesso di identificare tre classi di rischio per lo sviluppo e la precocità di comparsa di MTC: il più alto è correlato a mutazioni della porzione intracellulare della proteina, mentre il rischio, seppur alto, è minore per mutazioni della porzione extracellulare. Brandi et al. 2001 J Clin Endocrinol Metab 86: 5658–71 mutation site is one of the most important determining factors of risk and age-related penetrance of a specific RET mutation Moore et al. 2008 Pediatr Surg Int 24:521–530

RET mutations in Endocrinology

RET mutations in Endocrinology Sporadic MTC 40-50% of sporadic MTC display somatic RET mutations Romei et al. 1996 J Clin Endocrinol Metab 81:1619–1622 Zedenius et al. 1995 J Clin Endocrinol Metab 80:3088–3090 Schilling et al. 2001 Int J Cancer 95:62–66 Zedenius et al. 1998 Cancer Detect Prev 22:544–548 Somatic RET mutations correlate with presence of lymph node metastases at diagnosis worse outcome disease persistence after surgery lower survival rate Sarebbe inoltre importante identificare mutazioni somatiche di RET, ossia presenti solo nella neoplasia, poiché esse si associano ad una peggiore prognosi, dato che vi è una maggiore prevalenza di metastasi linfonodali alla diagnosi, persistenza di malattia dopo la chirurgia e minore sopravvivenza bad prognostic factor Elisei et al. 2008 J Clin Endocrinol Metab 93:682-7

RET mutations in Endocrinology La letteratura è ricca di contributi che illustrano le più frequenti mutazioni somatiche a carico di RET nell’MTC sporadico.

RET mutations in Endocrinology SURGERY total thyroidectomy with dissection of ipsilateral and central neck compartments ? contralateral dissection ? Sporadic MTC La terapia dell’MTC, come sappiamo, è in prima linea chirurgica. La tiroidectomia totale con dissezione dei linfonodi del compartimento centrale del collo è infatti indicata per le forme sporadiche ed ereditarie, nonché nei carrier asitomatici di mutazioni di RET, che porta ad ottener nella maggioranza dei casi livelli indosabili di calcitonina Hereditary MTC Asymptomatic RET mutation carriers before MTC occurrence undetectable CT levels in > 95% of cases Kouvaraki et al. Thyroid 2005 15: 531–544

RET mutations in Endocrinology SURGERY Ideally, prophylactic thyroidectomy should be undertaken before MTC develops in children Nai bambini portatori di mutazione l’intervento andrebbe fatto prima che la malattia si sviluppi, anche perché la tiroide ha ancora volume normale ed i pazienti sono giovani ed asintomatici, cosa che ne facilita il decordo post-operatorio normal thyroid volume asymptomatic young Miccoli et al. J Endocrinol Invest 2004;27: 557–61 Miccoli et al. Surg Endosc 2007;21: 120–3

within the first 6 months of life RET mutations in Endocrinology SURGERY Hereditary MTC Risk level Risk Surgery within 3 Highest within the first 6 months of life 2 High before 5 years of age 1 Least high between 5 and 10 years of age codon 918 codons 609, 611, 618, 620, 630, 634 Ma quando va fatto l’intervento? Questo dipende dal tipo di mutazione. Per quelle a maggior rischio, dovrebbe essere espletato entro i 6 mesi di vita, per quelle a rischio elevato entro i 5 anni e per le altre fra i 5 ed i 20 anni. L’aggressività dell’intervento è poi condizionata dalla presnza di metastasi linfonodali laterocervicali codons 768, 790, 791, 804 and 891 Falchetti et al. 2008 Best Pract Res Clin Rheumatol 22:149-63 aggressive neck dissection should be performed with lateral lymph node involvement

eliminate the possibility of extranodal growth RET mutations in Endocrinology SURGERY Very early surgical intervention (<2 yr for exon 9187 mutations or <10 yr) no need for additional lymph node dissection Preserve parathyroid glands autograft ≥ 10 involved lymph nodes no surgical cure L’intervento precoce spesso fa in modo che non sia necessaria la dissezione linfonodale laterocervicale, con minore incidenza di morbilità. Altri principi che dovrebbero essere tenuti presenti per l’intervento sono il risparmio delle paratiroidi sane, che possono anche essere autotrapiantate. Se il numero di linfonodi interessati è superiore a 10, inoltre, è inverosimile che l’intervento, pur mandatorio, risolva il quadro. I linfonodi vanno comunque tolti poiché in questo modo si evita un reintervento su un collo già problematico e si riduce il rischio di recidiva o diffusione metastasica della malattia. Machens et al. Cancer 2000; 88: 1909–15. Weber et al.. Surgery 2001; 130: 1044–9. Scollo et al. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88:2070–5. neck lymph node metastases dissection avoid reoperations Thomusch et al. Surgery 2003; 133: 180–5. Dralle et al. Surgery 2004; 136: 1310–22. eliminate the possibility of extranodal growth Machens et al. Surgery 2001; 129: 23–8

RET mutations in Endocrinology Questre evidenze sono state recentemente elaborate dall’American thryoid Association, che ha pubblicato su Thyroid le nuove linee guida per la gestione dei pazienti con diagnosi pre-chirurgica di mutazioni di RET,

RET mutations in Endocrinology Nonché dei pazienti con malattia clinicamente evidente.

TYROSINE KINASE INHIBITORS RET mutations in Endocrinology TYROSINE KINASE INHIBITORS La determinazione di mutazioni di RET, genomiche o somatiche, influenza anche l’eventuale terapia medica, poiché RET mutato è un bersaglio molecolare dei farmaci inibitori delle tirosin chinasi, molti dei quali sono entrati in trial clinici per la terapia medica dell’MTC

RET mutations in Endocrinology TYROSINE KINASE INHIBITORS phase II trials prolonged disease stabilization clinical benefits in 50% of the patients partial tumor responses in only few patients no improvement in survival so far I trial di fase 2 hanno dimostrato una prolungata stabilizzazione di malattia con beneficio clinico in almeno della metà dei pazienti. Però le risposte parziali misurabili con criteri recist sono poche e la sopravvivenza dei pazienti non sembra migliorare, suggerendo che inibire RET mutato non sia sufficiente per trattare l’MTC in fase di progressione Sherman J Clin Endocrin Metab published online March 3, 2009 targeting RET is not sufficient to treat all MTC tumors Schlumberger et al. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2008;4:22-32

RET mutations in Endocrinology Most MTC cases are cured by initial surgery when performed at an early stage Disease can persist or recur and metastasis can occur, with potentially serious effects on quality of life and mortality

RET mutations in Endocrinology New drugs that rely on knowledge of molecular oncology in MTC are available and are needed for patients with metastatic MTC Well-designed clinical trials should help in selecting the most active compounds

medullary thyroid carcinoma patients RET mutations in Endocrinology RET mutation analysis is a fundamental step in the diagnostic work-up in medullary thyroid carcinoma patients

Nuove acquisizioni sulla patogenesi dei tumori tiroidei

Riesco-Eizaguirre et al. Clin Transl Oncol 2007, 9:686-693 THYROID CANCER PATHOGENESIS Riesco-Eizaguirre et al. Clin Transl Oncol 2007, 9:686-693

THYROID CANCER PATHOGENESIS Average prevalence of mutations in thyroid cancer Tumor type Prevalence (%) Papillary carcinoma BRAF 45 RET/PTC 20 RAS 10 TRK <5 Follicular carcinoma PAX8-PPARg 35 PIK3CA <10 PTEN Tumor type Prevalence (%) Medullary carcinoma Familial forms of RET >95 Sporadic RET 50 Poorly differentiated carcinoma RAS 35 b-Catenin (CTNNB1) 20 TP53 BRAF 15 Anaplastic carcinoma 70 65 55 Nikiforov Y. Modern Pathology 2008, 21: S37–S43

Alterations can occur at different levels THYROID CANCER PATHOGENESIS MAPK signaling pathway Alterations can occur at different levels in thyroid cancer Nikiforov Y. Modern Pathology 2008, 21: S37–S43

THYROID CANCER PATHOGENESIS RET/PTC rearrangement intact RET TK domain binding to SHC RAS–RAF–MAPK activation RET  cell membrane receptor tyrosine kinase activated by chromosomal rearrangement RET 3’ portion fused to various unrelated genes 5’ portion RET/PTC1 = RET + H4 RET/PTC3 = RET + NCOA4

Nikiforova et al. Exp Rev Mol Diagn 2008, 8: 83 THYROID CANCER PATHOGENESIS PAPILLARY CARCINOMA RET/PTC1 and RET/PTC3 paracentric inversions 20% of PTC, mainly classical histology younger age radiation exposure  lymph node metastases lower stage (micro) found in adenomas and benign lesions Nikiforova et al. Exp Rev Mol Diagn 2008, 8: 83

tumorigenesis THYROID CANCER PATHOGENESIS RET/PTC rearrangement transforms thyroid cells in culture Santoro et al. Cell Growth Differ 1993;4:77–84 gives rise to thyroid carcinomas in transgenic mice Jhiang et al. Endocrinology 1996;137:375–378 Santoro et al. Oncogene 1996;12:1821–1826 Powell et al. Cancer Res 1998;58:5523–5528 requires a functional BRAF signaling tumorigenesis Melillo et al. J Clin Invest 2005;115:1068–1081 inhibits thyroid-specific gene expression increases cell proliferation Mitsutake et al. Cancer Res 2005;65: 2465–2473

THYROID CANCER PATHOGENESIS RET/PTC rearrangement Found in 62% of HT Sheils OM et al. Int J Surg Pathol 2000 ,8:185–189 Wirtschafter A et al. Laryngoscope 1997, 107:95–100 Rhoden KJ et al. J Clin Endocrinol Metab 2006, 91: 2414–2423 occult neoplasm ? Bias! technical limitations high false positive results lack of reproducibility

THYROID CANCER PATHOGENESIS RAS mutations H-RAS, K-RAS, N-RAS highly related G-proteins located at the inner surface of the cell membrane mediate intracellular signal transduction from cell membrane receptors many human neoplasms display point mutations mutant protein permanently in active conformation constitutively activates signaling pathways

THYROID CANCER PATHOGENESIS PAPILLARY CARCINOMA NRAS, HRAS or KRAS point mutations 15-20% of PTC, mainly follicular variant encapsulation  lymph node metastases also found in benign lesions Nikiforova et al. Exp Rev Mol Diagn 2008, 8: 83 Adeniran et al. Am J Surg Pathol 2006, 30: 216 Hara et al. Surgery 1994;116:1010–1016

+ + + + THYROID CANCER PATHOGENESIS RAS mutations PAPILLARY CARCINOMA RAS mutations TSH-dependent apoptosis + de-differentiation + TSH-independent growth + DNA damage + genomic instability Riesco-Eizaguirre et al. Endocrine-Related Cancer 2007, 14:957

Nikiforova et al. Exp Rev Mol Diagn 2008, 8: 83 THYROID CANCER PATHOGENESIS PAPILLARY CARCINOMA BRAF V600E point mutation [K601E and V599Ins] 45-80% of PTC, mainly tall cell and classic hystology  extrathyroidal invasion higher stage  recurrence (with reduced I up-take)  de-differentiation resticted to PTC Nikiforova et al. Exp Rev Mol Diagn 2008, 8: 83 Lupi et al. J Clin Endocrinol Metab. 2007;92:4085

- - + + THYROID CANCER PATHOGENESIS BRAF mutation(s) NIS expression PAPILLARY CARCINOMA BRAF up-regulates genes related to thyroid inflammation BRAF mutation(s) MMP, vimentin, osteopontin + Melillo et al. J Clin. Invest 2005, 115: 1068–1081 NIS expression - NIS trafficking to the membrane Riesco-Eizaguirre et al. Endocrine-Related Cancer 2006, 13: 257 - DNA synthesis and apoptosis + little growth advantage BUT genomic instability epithelial-mesenchimal transition Mitsutake et al. Cancer Research 2005;65: 2465 Vasko et al. Curr Opin Oncol 2007;19: 11

BRAF mutation screening THYROID CANCER PATHOGENESIS BRAF mutation screening Helpful to reduce PTC recurrence rate and avoid increase in complications to evaluate surgical aggressiveness of neck dissection Xing M Endocr Rev 2007,28:742 to plan aggressiveness of medical management

preoperative BRAF mutation test on FNAB? THYROID CANCER PATHOGENESIS High accuracy of BRAF mutation detection for PTC on FNAB specimens Xing M Endocr Relat Cancer 2005,12:245 cytologically diagnosed PTC preoperative BRAF mutation test on FNAB?

THYROID CANCER PATHOGENESIS Section of Endocrinology University of Ferrara BRAF mutation diagnostic FNAB from October 2007 to December 2008 suspicious for malignancy according to AACE/AME guidelines Gharib et al. Endocr Pract 2006 12 63-102. Solid isoechoic nodules shaded margins ± microcalcifications Biomolecular analysis 374 pz (262 ♀; 112 ♂) age 50.7 ± 0.7 (14-88) 469 FNAs EFE 2009 Pathology Zatelli MC et al. Eur J Endocrinol. 2009 Sep;161(3):467-73

Baloch et al. Diagn Cytopathol 2008 36 425-437 THYROID CANCER PATHOGENESIS FNAB cytological analysis benign follicular lesions follicular lesions of undetermined significance follicular neoplasm/suspicious for follicular neoplasm suspicious for malignancy malignant non diagnostic guidelines of National Cancer Institute Thyroid Fine Needle Aspiration State of the Science Conference Baloch et al. Diagn Cytopathol 2008 36 425-437

THYROID CANCER PATHOGENESIS BRAF V600E mutation analysis in nodule samples according to cytological category Cytological category samples BRAF+ BRAF- benign lesions 308  6  302  follicular lesions (89)   follicular lesions of undetermined significance 29 follicular neoplasm/suspicious 60 1 59 suspected malignant (18 PTC, 2 BC met, 2MTC) 22 10 12 malignant (45 PTC, 4 MTC) 49 31 18 inadequate total 469 48 421 Zatelli MC et al. Eur J Endocrinol. 2009 Sep;161(3):467-73

+ - THYROID CANCER PATHOGENESIS BRAF + incidence + 64% Section of Endocrinology University of Ferrara histologically confirmed as PTCs 41 with positive cytology 48 + 7 hystologically confirmed as PTCs 7 with negative cytology BRAF + incidence 64% + 469 BRAFV600E analysis 17 PTC 3 FA 2 BL 6 MTC 2 BC 421 - 30 with positive cytology 10 PTC fv 7 FTC 71 FA 88 follicular lesions 302 with negative cytology + 1 inadequate Zatelli MC et al. Eur J Endocrinol. 2009 Sep;161(3):467-73

THYROID CANCER PATHOGENESIS Statistical evaluation   PPV NPV sensitivity specificity accuracy Cytology 92,1% 95,9% 77,3% 98,8% 95,4% V600E BRAF mutation analysis 100,0% 93,7% 64,0% 94,4% Both 92,9% 97,5% 86,7% 96,9% McNemar test (with Yates correction) P < 0.01 Zatelli MC et al. Eur J Endocrinol. 2009 Sep;161(3):467-73

THYROID CANCER PATHOGENESIS BRAF V600E mutation analysis associated to FNAB cytology significantly increases PTC diagnostic accuracy of cytology in thyroid FNAB of clinically and US suspicious nodules may be added to pre-surgical risk evaluation of PTCs Zatelli MC et al. Eur J Endocrinol. 2009 Sep;161(3):467-73

THYROID CANCER PATHOGENESIS PAX8/PPARg rearrangement translocation t(2;3)(q13;p25) fusion between PAX8 gene and PPARg Kroll et al. Science 2000;289:1357–1360 aberrant PPARg protein overexpression cell transformation inhibition of normal PPARg function deregulation of PAX8 function Gregory Powell et al. Oncogene 2004;23:3634–3641 Reddi et al. Endocrinology 2007;148:932–935 activation of known PPAR target genes Giordano et al. Clin Cancer Res 2006;12:1983–1993

Nikiforova et al. Exp Rev Mol Diagn 2008, 8: 83 THYROID CANCER PATHOGENESIS FOLLICULAR CARCINOMA PPARg/PAX8 RAS PI3KCa AKT FTC initiation PTEN ? PPARg/PAX8 rearrangement t(2;3) (q13;p25) 45% of FTC younger age small tumor size  vascular invasion Also found in follicular adenomas and in Hurtle cell carcinomas Nikiforova et al. Exp Rev Mol Diagn 2008, 8: 83

Nikiforova et al. Exp Rev Mol Diagn 2008, 8: 83 THYROID CANCER PATHOGENESIS FOLLICULAR CARCINOMA PPARg/PAX8 RAS PI3KCa AKT FTC initiation PTEN ? NRAS and HRAS mutations 30% FA and 45% of FTC large tumor size distant metastases de-differentiation and poor prognosis Not specific ! Nikiforova et al. Exp Rev Mol Diagn 2008, 8: 83

Nikiforova et al. Mod Pathol 2004, 17 (suppl. 1):77A THYROID CANCER PATHOGENESIS FOLLICULAR CARCINOMA NRAS and HRAS mutations Follicular carcinoma + Follicular adenoma prophylactic surgery? Improved diagnostic accuracy in samples with negative or insufficient cytology Nikiforova et al. Mod Pathol 2004, 17 (suppl. 1):77A

Nikiforova et al. Exp Rev Mol Diagn 2008, 8: 83 THYROID CANCER PATHOGENESIS FOLLICULAR CARCINOMA PPARg/PAX8 RAS PI3KCa AKT FTC initiation PTEN ? PI3K/Akt pathway alterations PIK3CA mutations: 23% ATC and 8% FTC PTEN LOH: 7% FA and 27% of FTC Lack of large studies Nikiforova et al. Exp Rev Mol Diagn 2008, 8: 83

THYROID CANCER PATHOGENESIS ANAPLASTIC CARCINOMA p53 inactivating point mutations highly prevalent in ATC and PDC Ito et al. 1992 Cancer Res 52:1369–1371 Fagin et al. 1993 J Clin Invest 91:179–184 are not directly tumorigenic cooperation with other oncogenes is necessary for malignancy loss of differentiated phenotype Battista et al. 1995 Oncogene 11:2029–2037

THYROID CANCER PATHOGENESIS ANAPLASTIC CARCINOMA Mutations in anaplastic thyroid carcinomas Smallridge et al Endocrine-Related Cancer 2009,16:17–44

THYROID CANCER PATHOGENESIS ANAPLASTIC CARCINOMA Cytogenetic analyses in patients with anaplastic thyroid cancer Smallridge et al Endocrine-Related Cancer 2009,16:17–44

THYROID CANCER PATHOGENESIS Aberrant gene methylation aberrant gene transcription tumor suppressor genes tumorigenesis thyroid-specific genes radioiodine treatment failure clinical progression

THYROID CANCER PATHOGENESIS Microarray analysis gene expression radiation signatures DNA repair pathway susceptibility to develop radiation-induced cancer Detours et al. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes 15:440–445

thyroid cancer pathogenesis Why understanding thyroid cancer pathogenesis is so important?

THYROID CANCER PATHOGENESIS Receptor tyrosine kinase inhibitors in clinical trials in thyroid cancer Castellone et al, Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2008, 22: 1023–1038

In conclusion THYROID CANCER PATHOGENESIS much has been discovered concerning thyroid cancer pathogenesis preclinical studies help in characterizing the activity of new drugs and to validate their targets patients enrolled in clinical studies need to be genotyped for the compound target New opportunities to design clinical trials based upon tumor molecular profiling and preclinical studies of potentially synergistic combinatorial novel therapies