Microbiologia Enologica UNIVERSITÁ DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II FACOLTÀ DI AGRARIA CORSO DI LAUREA IN VITICOLTURA E ENOLOGIA DIPARTIMENTO DI AGRARIA Sezione di Scienza della Vite e del Vino Corso di Microbiologia Enologica Successione delle specie/ceppi di lievito durante la fermentazione spontanea

Non facilmente isolabili I lieviti sono molto diffusi in natura (disseminati dal vento e dagli insetti) Suolo Superficie dei vegetali Tubo digerente degli animali Sulla vite sono irregolarmente distribuiti Foglie, Raspi e Acini Verdi --> poco presenti Buccia del frutto in maturazione (essudati da microlesioni, stomi) anche spore di B. cinerea, LAB e batteri acetici ACINO (prima della raccolta) 103-105 UFC/g Regione geografica (clima caldo ) Stato di maturazione Stato sanitario Trattamenti con fitofarmaci ( ) Dopo raccolta, trasporto e pigiatura 106 UFC/g di mosto Rhodotorula Hanseniaspora uvarum (K. apiculata) Metschnikowia pulcherrima Candida stellata Candida famata (D. hanseni) Pichia membranefaciens Pichia fermentans Hansenula anomala S. cerevisiae e S. bayanus ASSENTI? In fermentazioni avviate in sterilità compaiono a metà del processo Non facilmente isolabili

Microrganismi dell’uva danneggiata Lieviti dell’uva integra 103 - 105 UFC/g 106 - 108 UFC/g Hanseniaspora uvarum (Kloeckera apiculata) Hanseniaspora guilliermondii (Kloeckera apis) Candida stellata Metschnikowia pulcherrima Cryptococcus Pichia Kluyveromyces Saccharomyces cerevisiae (< 50 UFC/g) rispetto alle uve integre si registra un aumento di muffe e batteri acetici

I batteri e le muffe dell’uva integra BATTERI LATTICI Lactobacillus Leuconostoc (e Oenococcus) Pediococcus MUFFE Botrytis cinerea Penicillium Aspergillus Mucor Rhizopus Alternaria Cladosporium BATTERI ACETICI Gluconobacter Acetobacter Gluconacetobacter

Composizione chimica del mosto d’uva Acqua: 70-85% Zuccheri: glucosio, detto anche "zucchero d'uva", maggiormente presente in uve parzialmente immature e, fruttosio, in grande percentuale in uve con maturazione completa. La percentuale di zuccheri presenti nel mosto determinerà il titolo alcolometrico del vino secondo l’assunto: percentuale di zucchero x 0,6 = volume alcolico% (da 1g di zucchero si ottengono 0,6 ml di alcol) Acidi organici: l'acido tartarico dal gusto duro, il più caratteristico delle uve, l'acido malico dal gusto aspro, più presente nelle zone a clima freddo, l'acido citrico dal gusto fresco ma decisamente meno presente degli altri. L' "acidità totale" di un mosto è determinata dalla somma di: acidi "fissi" (tartarico, malico, citrico, altri acidi minori) acidi "volatili" (acido acetico). Se l'acidità è adeguata il vino risulta serbevole e fresco, se è troppo bassa risulta piatto, se è alta risulta duro; l'acidità totale si esprime in g/l di acido tartarico, da 4‰a 9 ‰;

Composizione chimica del mosto d’uva Polifenoli (tannini e coloranti), sostanze che determinano il colore ed il sapore del vino; sono presenti nella buccia e nei raspi e agiscono anche come antiossidanti. Si classificano in: antociani (coloranti), che donano il colore rosso ai vini giovani; flavoni (coloranti), importanti per il colore dei vini bianchi; leucoantociani e catechine (tannini) che oltre al colore dei vini bianchi determinano il gusto astringente; Composti azotati: polipeptidi, aminoacidi e ammoniaca fondamentali per la crescita dei lieviti e quindi per la fermentazione Sostanze pectiche (pectine, gomme, mucillagini), che aumentano dopo la maturazione e diminuiscono dopo la fermentazione; gomme e mucillagini possono essere responsabili di intorbidamento; Sostanze odorose (terpèni), sono presenti nelle bucce in percentuali molto variabili nelle diverse uve; Elementi minerali: fosfati, solfati, sali di potassio, magnesio, calcio, ferro. Nella loro globalità definiti "ceneri" determinano la limpidezza e la sapidità del vino; Enzimi Fattori di crescita: vitamine idrosolubili (biotina, acido pantotenico)

*Biotina, acido pantotenico, tiamina e piridossina

Fattore limitante: pH compreso tra 3 e 3,5 Dunque, la composizione chimica del mosto d’uva è tale da soddisfare lo sviluppo di una vasta gamma di microrganismi Fattore limitante: pH compreso tra 3 e 3,5 Solo pochi microrganismi sono in grado di tollerarlo Lieviti: ottimo tra 4 e 4,5 - a pH 3 sviluppano senza difficoltà Batteri acetici: pur non crescendo tollerano pH 3 Batteri lattici: Oenococcus oenos e alcune specie di lattobacilli Muffe: poco influenzate

vigneto

Vigneto Cant ina

mosto

A N I D R E S O L F L I S O Z M A

C6 H12 O6 180,16 1 g 2 CO2 + 2 CH3CH2OH 2 x 44,01 2 x 46,07 0,489 g 0,511 g

Durante la fermentazione

Monitoraggio di lieviti autoctoni durante la fermentazione di mosto di uva Catalanesca Di Maro et al. (2007). Yeast dynamics during spontaneous wine fermentation of the Catalanesca grape. IJFM

G R A N O DOC

Moscato di Saracena

n° isolati (biotipi) per fase log ufc/ml on WL nutrient Agar Aglianico (Montoro Superiore, AV) ITS-RFLP types n° isolati totali n° isolati (biotipi) per fase 0 gg 3 gg 7 gg 11 gg 16 gg 25 gg 45 gg Pichia caribbica 1 2 2 (A)   Hanseniaspora opuntiae 2a 20 4 (B, C) 15 (F, G, H, I, L,M) 1 (O) Hanseniaspora uvarum 2b 4 3 (C, F) 1 (L) Candida apicola 3 1 (D) Metschnikowia pulcherrima 1 (E) Issatchenkia orientalis 5 3 (N, P) 1 (N) Candida zemplinina 6 1 (Q) Sachharomyces cerevisiae 7 48 2 (X) 9 (X, Y) 12 (X, Y) 15 (X, Y, Z) 10 (X ,Y) 81 11 15 10 12 16 log ufc/ml on WL nutrient Agar 5.72±0.08 7.82±0.04 6.89±0.15 7,31±0,04 6,86±0,03 4,86±0,06 6,43±0,18 ° Brix 23,00 22,00 15,00 10,50 8,00

I locali di vinificazione (pareti e pavimento), i recipienti e le attrezzature tra una annata e l’altra sono colonizzate da lieviti di specie poco fermentative Tuttavia c’è l’evidenza che, impiegando apparecchiature nuove, la fermentazione stenta a partire Si pensa che S. cerevisiae possa rimanere in cantina nell’intervallo tra due annate (trovata in botti) Prime ore di vinificazione: lieviti apiculati e M. pulcherrima. Dopo circa 20 ore: incomincia a svilupparsi S. cervisiae in quanto favorita da anaerobiosi, solfitaggio, concentrazione di zucchero ed etanolo Nella vinificazione in rosso: S. cerevisiae raggiunge 107-108 UFC/ml in poco tempo In mosti chiarificati (vinificazione in bianco): max 104-105 UFC/ml Dopo alcuni giorni dall’inizio della vendemmia: S. cervisiae rappresenta il 50 % dei lieviti dei mosti appena pigiati (colonizza i recipienti di raccolta e le attrezzature di cantina) Le successive vinificazioni mostrano una celere fermentazione Sfecciature statiche (a bassa temperatura) difficili da praticate

Nella fase finale della fermentazione (declino) S Nella fase finale della fermentazione (declino) S. cerevisiae si mantiene su 106 UFC/ml Verso la fine delle vinificazioni condotte regolarmente, rapido e completo consumo degli zuccheri, le altre specie di lievito possono essere presenti ma il loro numero è significativamente basso In alcuni casi: Brettanomyces intemedius responsabile di difetti olfattivi Durante il completamento delle fermentazione alcolica S. cerevisiae diminuisce rapidamente fino a raggiungere 102 UFC/ml Nel corso dell’affinamento o in bottiglia possono svilupparsi: Lieviti che ossidano l’etanolo e formano veli superficiali: Pichia (fioretta) Candida (fioretta) S. cerevisiae (flor) In anaerobiosi e con residui di zuccheri: Brettanomyces e Dekkera Lieviti da rifermentazione in vini non secchi: Saccharomycodes ludwigii Zygosaccharomyces bailii Ceppi di S. cerevisiae

alcool 4% alcool 8%  Saccharomyces cerevisiae Candida Kloeckera/ Hanseniaspora

Ci potremmo chiedere, inoltre Analisi della diversità clonale dei ceppi è resa possibile grazie all’avvento delle tecniche molecolari: RAPD-PCR, AFLP, mtDNA Figerprinting, micosatelliti, ecc. Come abbiamo visto la fermentazione è operata essenzialmente da una sola specie, S. cervisiae. Anche in questa specie esistono ceppi poco utili o addirittura dannosi dal punto di vista enologico Ci potremmo chiedere, inoltre *La fermentazione spontanea è operata da 1, pochi o molti ceppi di S. cerevisiae? *Si può evidenziare una successione di ceppi durante la fermentazione (uva-vino)? *Sono sempre gli stessi i ceppi che operano in diverse annate nella stessa cantina o nello stesso cru? * La pratica dell’inoculo con ceppi selezionati può modificare la microflora autoctona del cru? In molti casi studiati di fermentazione di uve rosse o di vini bianchi secchi: - Pochi ceppi (1-3) rappresentano il 70-80% dominano microflora - I ceppi dominanti si ritrovano dall’inizio alla fine della fermentazione e nei recipienti - I ceppi dominanti ricorrono in proporzioni paragonabili

Nella vinificazione di una stessa cru nella stessa cantina si verifica con gli stessi ceppi - Le pompe per i rimontaggi nei (vini rossi) - Le apparecchiature di torchiatura (vini bianchi) Concorrono a disseminare gli stessi ceppi La presenza, ogni anno, dello stesso ceppo in uno stesso vigneto non ha nulla di sistematico. Il concetto di “lievito cru” non è confermata da osservazione enologiche In alcuni casi è stata osservata una notevole variabilità clonale con incidenze variabili sia durante il corso della fermentazione che su tini di fermentazione diversi. -questa situazione sembra essere correlata a fermentazioni lente e spesso incomplete I lieviti selezionati, aggiunti come colture starter, spesso (nelle vinificazioni in rosso) sono in grado di prendere il sopravvento sulla microflora autoctona. Al contrario, nelle vinificazioni in bianco, questo risulta più difficile a causa dell’assenza dei rimontaggi che favoriscono la disseminazione dei ceppi

Fermentazioni scalari (con starter misti) Il metodo super-quattro Interventi sulla fermentazione dei mosti La fermentazione spontanea dei mosti da parte dei numerosi lieviti che intervengono nel processo è una pratica oramai in disuso. Oggi vengono praticati numerosi interventi per evitare lo sviluppo dei “lieviti selvaggi” (apiculati come Kloeckera e Hanseniaspora ai quali si attribuiscono i difetti di dare origine a fermentazioni poco pulite e incomplete) a favore dei lieviti ellittici della specie Saccharomyces cerevisiae, mediante fermentazioni guidate: Impiego di lieviti selezionati (autoctoni possibilmente) Fermentazioni scalari (con starter misti) Il metodo super-quattro La pastorizzazione dei mosti L’impiego dell’anidride solforosa

Ceppi isolati da uva Catalanesca 5y35b 5y32a 5y33b 5y38a 

(ceppi isolati dalla Catalanesca) ITS Hae III-RFLP (ceppi isolati dalla Catalanesca) Non -Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae

Polimorfismo dell’ITS (ITS1-5,8S-ITS2)

Grado alcolico al 17° giorno B = 12,7 C = 11,7

Campione A mosto inoculato con il ceppo 5Y32a gg di fermetazione pH °Brix Acidità totale (g/L) volatile (g/L) Zuccheri riducenti (%) Grado alcolico (%) Polifenoli totali (mg/L) Colore SO2 libera (mg /L) SO2 totale (mg/L) A 3 3,52 20,7 5,29 0,1 18,63 1 561,98 0,532 12,79 61,45 7 15,6 5,34 0,23 10,43 5,92 523,48 0,489 10,46 59,72 17 3,58 5,12 0,52 0,38 13,8 501,42 0,471 4,53 26,84 100 3.44 / 6.52 0.55 449 0.525 4.18 52.95 B 3,55 20,4 5,14 0,13 18,38 1,05 501,08 0,513 11,55 65,87 3,53 15 5,77 0,32 10,78 5,56 321,76 0,324 9,43 63,92 6,35 0,47 0,54 12,7 258,57 0,317 4,13 38,35 3.38 6.71 0.52 270 0.32 3.48 62.07 C 3,66 22,4 3,92 0,15 19,16 0,73 515,55 0,562 10,04 62,33 3,62 20 5,23 0,43 18,25 1,25 433,63 0,378 9,06 62,06 3,6 8,8 5,21 0,68 0,93 11,7 301 0,263 4,22 28,28 3.41 7.23 0.65 305 0.295 46.72 Campione A mosto inoculato con il ceppo 5Y32a Campione B mosto inoculato con il ceppo 5Y35b Campione C mosto tal quale (controllo)

Mosto Zona DOC Pollino alla temperatura di 18-20 °C Autoctoni Commerciali

Interazioni cellula-cellula Produzione di peptidi antimicrobici