Perché trasformare le piante? Rese e valori nutrizionali più elevati Resistenza a insetti e virus Resistenza a erbicidi/insetticidi Resistenza a stress ambientali (es. siccità) Ritardo della senescenza Miglioramento caratteristiche ornamentali Produzione di proteine e/o metaboliti a basso costo (bioreattori vegetali) Sistemi di trasformazione delle piante: Trasferimento tramite plasmide Ti (Agrobacterium tumefaciens) Microproiettili Trasferimento diretto, elettroporazione (protoplasti rigenerabili) Vettori virali, microiniezione, fusione liposomi (poco usati)

Caratteristiche dei sistemi di trasformazione delle piante Applicazione della tecnologia del DNA ricombinante Disponibilità di elementi genetici regolativi vegetali (promotori, terminatori, enhancers etc) Disponibilità di elementi genetici strutturali (sequenze di inserzione, trasposasi, etc) Disponibilità di marcatori di selezione e reporter Cellule vegetali totipotenti

Visualizzazione del marcatore beta-glucuronidasi (GUS) in tessuti di piante trasformate

Trasformazione delle piante tramite Ti di Agrobacterium tumefaciens Batterio gram-negativo, flagellato, aerobico, non sporigeno del suolo Fitopatogeno di dicotiledoni (vite, alberi da frutto, rose etc)

Tumore del colletto: Attacco del batterio alle cellule del colletto Attivazione geni vir Trasferimento del T-DNA del plasmide Ti dal batterio alle cellule della pianta Inserzione del T-DNA nel genoma dell’ospite Induzione dei geni contenuti nel T-DNA (sintesi auxina e citochinina)  crescita cellulare vegetale incontrollata (tumore) Induzione dei geni biosintetici per le opine (octopina, agropina, nopalina) Secrezione delle opine Utilizzo delle opine: solo gli A. tumefaciens che posseggono plasmidi Ti con geni per il catabolismo dell’opina possono usare questi prodotti come fonte di carbonio rosa vite

MAPPA DEL PLASMIDE Ti

Vettori per piante transgeniche: eliminare i geni biosintetici per ormoni eliminare geni biosintetici per opine introduzione marcatore per pianta introduzione di sequenze di regolazione e MCS eliminare altre sequenze non necessarie (es geni per il catabolismo delle opine introduzione ORI per E. coli introduzione marcatore per E. coli e A. tumefaciens Sistema binario: necessita un Ti helper con geni vir in trans Sistema ad integrazione con Ti helper

PROBLEMATICHE della PPE in PIANTE Aspetti positivi: Modificazioni post-traduzionali necessarie all'attivita' biologica (acetilazione, fosforilazione, glicosilazione etc) Produzione mirata in differenti organi delle piante tramite elementi di espressione organo-specifica: foglie, frutti, radici, semi Produzione mirata in differenti comparti cellulari tramite bio-ingegnerizzazione della proteina (peptidi segnale): citoplasma, ER, spazio intercellulare (apoplasto) Aspetti negativi: Estrazione e purificazione del prodotto da pianta costosi Costi alti e rese di produzione basse da cellule o organi coltivati in vitro

Scopo del lavoro: sfruttare il sistema di secrezione delle radici di piante intatte per produrre PE nella rizosfera Concetto di RIZOSECREZIONE: composti chimici e proteine vengono secreti dalle cellule della radice (via ER) nell'apoplasto e quindi nella rizosfera. PE indirizzate nell'ER e quindi nell'apoplasto sarebbero quindi continuamente secrete nel mezzo di coltura.

Proteine modello selezionate per la produzione in tabacco: Xilanasi batterica GFP (green fluorescent protein) di medusa SEAP (fosfatasi alcalina di placenta) Promotori utilizzati: (CaMV)35S = forte e costitutivo mas2' = forte e tessuto-specifico (mannopina sintasi, espressa nella radice)

PRODUZIONE DI XILANASI Utilizzati semi transgenici contenenti la xilanasi sotto il controllo del promotore CaMV35S e il peptide segnale dell'inibitore II di proteinasi per l'indirizzamento nell' ER. L'espressione e' ubiquitaria (prom. 35S). Piante transgeniche cresciute su colorante RemazoloBB-xilano idrolizzano il substrato a causa dell'enzima secreto dalle radici (figura 1: wt vs transgenico) Figure 1: Rhizosecretion of bacterial xylanase from transgenic tobacco. Untransformed (left) and xylanase-transformed tobacco plants after 32 day-cultivation on the RBB-xylan containing agar medium (photographed upside down). The smaller size of the control plant is likely due to toxic effects of the uncleaved RBB-xylan.

PRODUZIONE DI GFP Cassette di espressione (figura 2A): GFP con peptide segnale (car) di Calreticolina (proteina dell'ER coinvolta nell' omeostasi del calcio e con funzioni di chaperonina) e promotore mas2' che si esprime preferenzialmente in cellule di radice (cassetta carGFP) GFP senza peptide segnale e con promotore ubiquitario CaMV35S (cassetta cmGFP ad espressione citoplasmatica)

TRASFORMAZIONE Trasformazione di cellule fogliari Selezione dei trasformanti resistenti alla kanamicina Rigenerazione delle piantine transgeniche Trasferimento delle piantine in coltura idroponica METODI DI INDAGINE Northern e western blotting Microscopia confocale e a fluorescenza Fluorimetria diretta sugli essudati

ANALISI della GFP Confronto tra radici wt vs transgenico (carGFP) con microscopia a fluorescenza: solo la radice transgenica emette fluorescenza (figura 2B) Differenza di localizzazione tra piante transgeniche carGFP e cmGFP determinata con microscopia laser confocale: carGFP e' indirizzata nell' ER e quindi nell'apoplasto (figura 2C) Secrezione di GFP nel mezzo di coltura, visualizzazione con luce UV e luce normale, confronto fra pianta transgenica carGFP e wt (figura 2D) Analisi spettrofotometrica del terreno (eccitamento a 390 nm ed emissione tra 300 e 600 nm): il picco a 510 nm, assente nel terreno di piante wt, e' caratteristico della GFP (figura 2E) t Figure 2: Rhizosecretion of GFP from transgenic tobacco. (B) Fluorescence microscopy image of an untransformed root (left) and the carGFP transformed root (right). (C) Confocal image of living root cortex cells: carGFP (left) and cmGFP (right). (D) Visualization of GFP rhizosecretion. CarGFP transformants (left in each picture) were kept in the hydroponic system for 2 weeks and compared with nontransformed controls under the bottom illumination with ultraviolet light (left photograph) and under normal room light (right photograph). (E) Fluorescence emission spectrum of root exudates of carGFP tobacco plant determined at excitation 390 nm and emission 300–600 nm (left) compared with the emission spectrum of root exudates of untransformed control plant (right).

Analisi delle proteine con anticorpi antiGFP (western, figura 2F) in colture di piante transgeniche carGFP: Estratti di radice Apoplasto Terreno Le concentrazioni di GFP (2 > 3 >>> 1) suggeriscono che il passaggio 2  3 va secondo gradiente di concentrazione. Il passaggio 1  2 e' invece a trasporto attivo/traslocazione (secrezione) Figure 2: Rhizosecretion of GFP from transgenic tobacco. (F) Western blot detection of recombinant GFP in transgenic line 75 (carGFP ). Five-microgram fractions of the total soluble proteins from root extract (line 1), root intercellular space (line 2), and root exudates (line 3) were separated by 12% SDS-PAGE, transferred on the PVDF membrane and incubated with the GFP-specific monoclonal antibodies.

Analisi dell' mRNA e di proteine in essudati in piante transgeniche cmGFP (1 e 2) vs piante transgeniche carGFP (3, 4 e 5). Sia in cmGFP che in carGFP il trascritto e' abbondante ma solo in essudati di carGFP si trova la proteina (figura 2G). Se ne conclude che in piante transgeniche carGFP la GFP non viene secreta per rilascio passivo attraverso le membrane o per rottura cellulare, ma attraverso l'apparato di secrezione, via ER. Figure 2: Rhizosecretion of GFP from transgenic tobacco. (G) Comparative analysis of GFP in root exudates of cmGFP and carGFP plants. Top panel: Northern blot analysis of GFP mRNA from roots of two representative cmGFP plants (lines 1 and 2) and three representative carGFP plants (lines 3, 4, and 5). Bottom panel: Western blot analysis of the proteins rhizosecreted by the same plants over 14-day period. The equal amounts of total protein (10   g) were loaded into each slot of SDS-PAGE and processed as in (F).

RESA di GFP 0.3-1 g/g (peso secco di radice). Non indicata dagli autori la produttivita' per unita' di tempo: per giorno? PRODUZIONE di SEAP Proteina non ancora espressa in pianta. Utilizzata una forma tronca priva del dominio di legame alla membrana per permettere una secrezione efficiente. Utilizzato il peptide segnale di SEAP stessa Utilizzati i due promotori CaMV35S e mas2' (cassette di espressione: figura 3A) Metodi di indagine utilizzati: Northern blotting Attivita' fosfatasica con test di bioluminescenza

Analisi mRNA (figura 3B): tutte le piante transgeniche kanR che esprimono (35S)SEAP mRNA hanno attivita' fosfatasica nelle foglie (LF) e negli essudati di radice (impulsi1000). Il controllo wt (C) e i cloni kanR che non esprimono (35S)SEAP non hanno attivita' fosfatasica (campioni 8 e 31) Figure 3: Rhizosecretion of SEAP from transgenic tobacco. (B) Expression of SEAP mRNA and enzymatic activity in pNB35S-SEAP plants, lines A1–33; C, untransformed control. Top panel: Northern blot hybridization using agarose purified BamHI-XbaI of pSEAP2-Enhancer plasmid for the preparation of specific hybridization probe. Middle panel: Chemiluminescent determination of SEAP activity in leaf intercellular fluid. Bottom panel: SEAP activity in the root exudates 14 days after rooting in the hydroponic system. Protein activity is represented as impulses/10 s per 25   l of the sample.

La proteina attiva negli estratti, nell'apoplasto e negli essudati e' la stessa e corrisponde al MW previsto per SEAP (vedi 2 campioni positivi (35S)SEAP vs wt in figura 3C: identificazione di attivita' fosfatasica in gel non denaturante (MW?) Figure 3: Rhizosecretion of SEAP from transgenic tobacco. (C). Visualization of SEAP activity in the native gel. Thirty micrograms of total protein isolated from root extracts, root extracellular fluid, and root exudates of transgenic plants 33 (lines 1, 3, and 5) and A1 (lines 2, 4, and 6) as well as from the control wild-type tobacco (lines 7 and 8) were separated on native PAGE, and SEAP activity was localized using the Alkaline Phosphatase Isoenzymes procedure (Sigma, St. Louis, MO).

RESA di SEAP L'espressione e la secrezione di SEAP da piante transgeniche (mas2')SEAP e' simile a (35S)SEAP, ma la produzione e' maggiore: 20 g/g vs 5.8 g/g (per peso secco di radice) La produzione totale e' distribuita al 79% nel terreno e al 21% nella pianta (apoplasto e cellule) SEAP rappresenta il 3% della proteina totale secreta dalla pianta: valore nella media della PPE da altre piante/tessuti/organi VANTAGGI DEL SISTEMA La secrezione nel terreno puo' essere applicata in continuo senza distruggere la pianta Considerata la vita media della pianta di tabacco (120 giorni) e la produzione media giornaliera (20 g/g) si puo' arrivare ad una produzione totale di 2.4 mg/g. La coltura idroponica e' suscettibile a scaling-up Il costo di estrazione e purificazione e' in media il 90% del costo del processo: la secrezione in terreno liquido dovrebbe abbattere sensibilmente questo costo Minore rischio di contaminazioni del prodotto da patogeni per l'uomo rispetto a PE prodotte da ospiti animali