Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo Le tecniche sono molto utilizzate, permettendo l’analisi di miscele complesse come sono la maggior parte dei campioni di natura organica Miscela iniziale Miscela separata nei suoi componenti Sistema cromatografico

GENERALITÀ SULLA CROMATOGRAFIA La cromatografia comprende una grande varietà di tecniche di separazione, il cui denominatore comune è il fatto che i componenti della miscela da separare si distribuiscono tra due fasi, una della quali rimane fissa (fase stazionaria), mentre l'altra mobile si muove a stretto contatto con la prima. I diversi componenti della miscela migrano sulla fase stazionaria sotto la influenza della fase mobile con diversa velocità subendo, una migrazione differenziale, che porta alla loro separazione. La fase stazionaria può essere disposta in una colonna ovvero su di un piano come nella cromatografia su carta e su strato sottile, e se essa è un liquido può rivestire un solido inerte utilizzato in polvere o in granuli di data dimensione. Durante il processo cromatografico la fase mobile, che può essere o un gas un liquido, ed in cui possono disciogliersi i soluti, che costituiscono la miscela, fluisce in continuo contatto con la fase stazionaria.

GENERALITÀ SULLA CROMATOGRAFIA La separazione dei vari costituenti di una miscela può realizzarsi se questi si distribuiscono fra fase mobile e fase stazionaria in modo differente e cioè secondo un diverso rapporto di distribuzione.

Meccanismi cromatografici. Durante un processo cromatografico le molecole di soluto passano in continuo dalla fase stazionaria a quella mobile e da questa nuovamente nella fase stazionaria e tale trasferimento si ripete per un gran numero di volte. Per effetto di tale trasferimento le molecole, quando si trovano nella fase mobile procedono, mentre sono praticamente ferme durante il tempo in cui permangono nella fase stazionaria La velocità di migrazione di ciascun soluto è determinata dal rapporto fra i tempi che esso trascorre nelle due fasi e cioè dal suo rapporto di distribuzione. I processi mediante i quali un soluto può essere trasferito da una fase mobile ad una stazionaria sono quelli di : adsorbimento ripartizione, scambio ionico esclusione affinità

Perché un fenomeno fisico possa essere sfruttato per una separazione cromatografica deve presentare due caratteristiche: LA SELETTIVITÀ: l'intensità del fenomeno deve essere diversa per ciascun componente della miscela; solo in questo modo sarà possibile una differenziazione. LA REVERSIBILITÀ: sia perchè alcuni fenomeni sono dinamici (es. adsorb.), sia per poter recuperare i componenti della miscela dopo la separazione.

ADSORBIMENTO La fase stazionaria è un solido sulla cui superficie si trovano dei siti attivi in grado di stabilire una serie di legami chimici secondari (dipolo- dipolo, ponte idrogeno.Van derWaals.) con le diverse molecole della miscela da risolvere Il fenomeno dell'adsorbimento determina un addensamento delle particelle in prossimità della superficie del solido. Questo fenomeno si osserva sia nell'interfaccia solido-gas sia nei sistemi solido-liquido.

Ogni sostanza si ripartisce in un modo che le è proprio. RIPARTIZIONE Se la fase stazionaria è un liquido, si verifica una vera e propria solubilizzazione delle sostanze nella fase stazionaria. Esse pertanto si ripartiscono fra le due fasi immiscibili fra loro. Ogni sostanza si ripartisce in un modo che le è proprio. . Quando fa fase mobile è un gas, si parta di Cromatografia Gas Liquido (GLC, gas liquid chromatography) mentre se è un liquido si ha la Cromatografia LiquidoLiquido (LLC, liquid liquid chromatography).

SCAMBIO IONICO Alla fase solida stazionaria, che in questo tipo di cromatografìa viene detta generalmente resina, sono attaccati in modo covalente anioni (- SO3) o cationi( sali di ammonio quaternari –NR3) Gli ioni presenti nel soluto, di carica opposta a quella presente nella resina, vengono attratti dalla fase stazionaria dalla forza elettrostatica, formando dei legami ionici A seconda della maggiore competitività e dunque dell'affinità verso la fase stazionaria gli ioni del campione vengono perciò selezionati durante il loro passaggio e dunque separati fra loro. (IEC Ion exchange cromatography)

La fase stazionaria è un solido poroso o, soprattutto, un gel caratterizzato da pori di dimensioni molto variabili a seconda del tipo di molecole e della tecnica di preparazione. Le molecole del soluto che vengono a contatto con il gel penetrano nei pori e sono così variamente trattenute dalla fase stazionaria per un certo tempo. Invece, se sono di dimensioni troppo grandi per entrare, vengono letteralmente escluse (da cui il nome della tecnica) e raggiungono la coda della colonna insieme al solvente, con grande rapidità.

la cromatografia di affinità Solo un tipo di molecola della miscela si lega a una molecola legata covalentemente alla fase stazionaria Tutte le altre molecola scorrono semplicemente attraverso al colonna Da un certo punto di vista, la cromatografia di affinità (AC, Affinity chromatography) rappresenta una variante dell'adsorbimento Questa tecnica viene condotta in due stadi. In un primo tempo si opera in modo che il meccanismo dell'interazione soluto fase stazionaria consista in reazioni biochimiche reversibili, molto specifiche. Nella seconda fase, cambiando le caratteristiche dell’eluente si scindono i legami precedentemente instaurati fra soluto e fase stazionaria ottenendo l'eluizione selettiva dei componenti di una miscela