Storia E’ il primo processo fungigno con potenzialità industriali ad essere stato scoperto: 1983 scoperta della produzione di citrato da muffe 1900 produzione di citrato da agrumi (7-9% citrato) 1913 primi brevetti di produzione di citrato da Aspergillus niger - impiego della procedura di sterilizzazione del terreno - impiego di terreni a basso pH (2-3) - impiego dell’inibizione della crescita del micelio - impiego di alte concentrazioni di zuccheri 1919 primo impianto in Belgio (processi di superficie) 1928 uso di molasse di barbabietola come base del terreno, ma con rese basse a causa della presenza di metalli 1933 diffusione degli impianti di fermentazione e crollo dell’estrazione da agrumi 1950 - uso di esaciano ferrato (HCF) o resine a scambio ionico per il trattamento del terreno al fine di - eliminare i metalli - elucidazione delle vie metaboliche che portano al citrato (glicolisi, TCA) - regolazione del metabolismo; ancora oggetto di studio - primi impianti sommersi che usano fonti C economiche, come molasse e amidi 1960 fonti C alternative: uso di n-alcani con batteri e lieviti (specie Corynebacterium, Brevibacterium, Candida). Apprezzabile produzione di citrato ma anche di isocitrato, che rende il processo poco economico: si può ridurre l’isocitrato riducendo il ferro e quindi riducendo l’attivitaà della aconitasi Attualmente i processi sono sommersi, con carboidrati come fonte C e specie di Aspergillus come microrganismi

Il citrato non viene secreto (sovrapprodotto) in un metabolismo normale. Solo pochi microrganismi sono buoni secretori: condizioni colturali particolari imposte  sbilanciamento nella regolazione del metabolismo sovrapproduzione di citrato I microrganismi più utilizzati sono: diverse specie del genere Aspergillus altre muffe, tra cui Trichoderma viride (che contiene anche delle cellulasi) batteri dei generi Corynebacterium o Brevibacterium lieviti del genere Candida

Le condizioni devono in genere essere tali per cui la crescita deve essere limitata/impedita, ad esempio a causa di qualche fattore limitante. Alcune condizioni favorevoli alla produzione sono: alta concentrazione di zuccheri (ma non eccessiva: produzione dell’ossalato) elevata ossigenazione basso pH ( 2); il pH elevato (>5) favorisce, tra l’altro, la produzione di ossalato bassa concentrazione di fosfati bassa concentrazione di metalli bivalenti (manganese, ferro e zinco)

Gli zuccheri: facilmente assimilabili (glucosio, saccarosio: no polimeri) e ad una concentrazione del 15-25%   Azoto: ammonio solfato o nitrato. L’ammonio ha il vantaggio che consumandosi fa abbassare il pH. L’ammonio non deve essere limitante e va riaggiunto quando si consuma; 0.3-1.5 g/L Fosforo: la concentrazione di fosfato deve essere bassa in terreni non trattati per ridurre i metalli pH: si ottiene citrato a pH<3, a pH più elevati si ottiene preferenzialmente ossalato e/o gluconato (da glucosio ossidasi extracellulari) Ossigenazione: la quantità di ossigeno disponibile (DOT=dissolved oxygen tension) deve essere elevata (>140 mBar) ed e’ un parametro critico per la produzione. Un’interruzione di areazione può provocare dei danni irreversibili alla produzione di citrato, anche se non alla crescita del micelio Metalli: ferro e zinco bivalenti devono essere eliminati in terreni ad alto fosfato, o viceversa. Anche rame e manganese devono essere bassi. I metalli vengono eliminati per precipitazione con esacianoferrato. Si è osservato che, riaggiungendo i metalli ad uno ad uno al terreno, quello critico per la produzione è il manganese

Le vie metaboliche sono regolate in modo da consentire alla cellula di non sprecare energia: la sovrapproduzione di un metabolita primario esige quindi che si superi il controllo metabolico mediante alterazioni indotte da condizioni ambientali particolari, oppure mediante selezione di mutanti deregolati.   A. niger utilizza il glucosio via EMP e HMP. Nella fase di crescita il rapporto EMP/HMP è 2:1, nella fase produttiva è 4:1. Quindi bisogna andare a cercare nella glicolisi e nella sua regolazione le ragioni della sovrapproduzione. Trasporto e fosforilazione del glucosio: l'elevata concentrazione di glucosio stimola il trasporto e le esosokinasi, che sono i prerequisiti per l'elevato flusso glicolitico e l'attivazione degli enzimi glicolitici chiave.

PFK1: indotta da fruttosio 2,6 bisfosfato, ammonio e AMP, inibita da PEP, ATP e citrato. L’enzima deve quindi essere desensibilizzato al citrato. Ipotesi: l'elevata concentrazione di fruttosio-6P stimola la sintesi dell'induttore fruttosio 2,6 bisfosfato (enzima PFK2) che a sua volta stimola il flusso glicolitico (produzione di fruttosio 1,6bisP).

ICDH: le mitocondriali (NADP+ dipendenti) sono inibite da citrato e NADH.   KGDH: catalizza l’unica reazione irreversibile del TCA, è inibita da ossalacetato, cis-aconitato e NADH (schema TCA).

PC e PDH: competono per il piruvato. PC è indotta da alte concentrazioni di glucosio in A. niger. PC è citoplasmatica nei funghi: problema della compartimentazione dei metaboliti. Lo scambio malato/citrato porta il citato nel citoplasma e favorisce la secrezione.

Manganese La deficienza di manganese ha due effetti metabolici: 1. Abbassa l’ attività degli enzimi di HMP e TCA 2. Aumenta il turnover proteico: proteasi più attive → aumento di AMMONIO. L’ammonio attiva la PFK antagonizzando l’azione del citrato e aumenta di conseguenza il flusso glicolitico 3. Altri effetti della carenza di manganese (che possono avere un effetto sulla produzione): • Composizione lipidica alterata • Sintesi parete cellulare • Morfologia delle ife

Ossigeno A. niger ha una catena respiratoria ramificata: 1. Via sensibile ad antimicina e CN- 2. Via sensibile ad acido salicilidrossamico (SHAM) In altri organismi si è visto che la via SHAM riossida NADH SENZA PRODURRE ATP: la riduzione di ATP blocca la crescita e stimola la glicolisi. La riduzione della DOT inattiva irreversibilmente la sintesi di citrato senza bloccare la crescita, quindi le alte DOT sarebbero necessarie per mantenere attiva la SHAM

CH3COCOOH piruvato COOHCH2COCOOH ossalacetato OAA idrolasi, H2O citoplasmatica pH >5 piruvato COOHCH2CHOHCOOH malato CH3COOH + COOHCOOH Acetato + ossalato

Sulla base di queste informazioni, LA SOVRAPPRODUZIONE DI CITRATO dipende dalla DEREGOLAZIONE DEL FLUSSO GLICOLITICO e dallo SCAMBIO malato/citrato dal TRASPORTATORE MITOCONDRIALE (peraltro non ancora caratterizzato)

Ceppi produttori (lavoro protetto da segreto industriale): • isolamento da habitat naturali • subclonaggio di produttori potenti (es. su agar con indicatore di pH) • metodi potenzialmente adatti a isolare nuovi produttori: • mutagenesi UV e selezione • generazione di eterocarion e/o poliploidi con nuove caratteristiche (es tramite fusione di protopasti o cicli parasessuali) • applicazione di metodi di genetica molecolare (resistenza a particolari componenti del terreno, uso di fonti C come amido, cellulosa etc) • molto lavoro sulle condizioni colturali Terreni: a base di molasse di canna o di barbabietola oppure idrolisati d’amido addizionati con nitrato d'ammonio, fosfato di potassio, solfato di magnesio Precoltura: si inocula direttamente il fermentatore con una preparazione di spore o precoltura di micelio: in genere non c‘è scaling up

Processo KOJI: Si usa amido imbibito d’acqua su vassoi e inoculato con spore di A. niger Terreno preparato a pH 5.5 e tenuto a 30°C Si fanno agire dapprima le amilasi di A. niger o si saccarifica preventivamente l’amido con amilasi aggiunte In seguito si ottiene la trasformazione del glucosio in citrato (pH  2)   Fermentazione in superficie (si usano vassoi in alluminio puro, no ferro!!, controllo stretto di temperatura, aria e umidità): Diluizione delle molasse fino a 15-20% di zuccheri Acidificazione e riscaldamento Aggiunta di K+HCF- per la precipitazione dei metalli Inoculo del terreno con spore di A. niger Germinazione (2 giorni) e formazione del micelio superficiale Mantenimento della temperatura a 30°C e insufflamento di aria sterile Il pH 2 e dopo 6-8 giorni termina la fermentazione Rese: 75 g per 100 g glucosio

Metodi sommersi: bassi costi associati a rese e produttività elevate (in fermentatori agitati a torre fino a 1000 m3 in acciaio molto resistente: l’acido citrico è corrosivo): Diluizione del terreno (15-27% zuccheri) Rimozione cationi (HCF- o resine): concentrazione critica per Mn=2g/L) Sterilizzazione Acidificazione a pH 3 Inoculo con spore o micelio Areazione (>25% della saturazione) e controllo della temperatura (28-30°C) Dopo 2-3 giorni si ha la formazione del micelio Dopo 5-10 giorni si ha la conversione completa in citrato (vedi grafico) Al processo puro batch si preferisce un fed-batch parziale con una partenza a basso zucchero e fed successivi più elevati

Recupero del CITRATO: Nelle fermentazioni di superficie si recupera il terreno e si pressa il micelio che contiene ancora parecchio citrato. Nelle sommerse il micelio si separa per centrifugazione. Il micelio può essere riciclato come mangime. Il terreno (+ il recupero dal micelio pressato) viene trattato come segue: - Precipitazione del citrato con Ca(OH)2 e lavaggio del precipitato - Acidificazione con H2SO4 → CaSO4 e acido citrico - L’acido citrico viene purificato con resine o carboni attivi - Evaporazione → precipitazione dell’acido citrico cristallino

Mercato del citrato: 1. Industria alimentare (bevande, dolci, marmellate etc): gusto piacevole e prodotto ‘sicuro’ (GRAS), circa 60% del mercato 2. Industria cosmetica 3. Industria farmaceutica (2+3 = 10%) 4. Detergenti (biodegradabile) 5. Plastiche (ammorbidente) 6. Chimica (4+5+6=30%)