Studi di sopravvivenza cellulare e valutazione del danno cromosomico tramite test del micronucleo M. Balduzzi, C. Patrono, C. Marino, A. Testa (UTBIORAD - ENEA c.r. Casaccia) STATO DELL’ AVANZAMENTO DEL PROGETTO TOP-IMPLART WORKSHOP INTERNO ENEA c.r. Frascati 25 Febbraio 2015

Caratterizzazione biologica del fascio di protoni con cellule CHO Irraggiamento con protoni da 5 MeV presso l’acceleratore TOP-IMPLART Test del micronucleo (MN) Aberrazioni cromosomiche (CA) Dati di sopravvivenza cellulare Linea CHO è stata largamente utilizzata per studi di radiobiologia in quanto modello stabile e sensibile…. Le CHO hanno morfologia di tipo epileliale, crescono come monolayer con un tempo di duplicazione di circa 12 H. Confronto con i dati raccolti nell’ambito del progetto BioQuaRT irraggiamenti con protoni da 10 MeV (LET 5 keV/µm) e 3 MeV (LET 18 keV/µm) mediante tecnologia del “microbeam” a singolo ione

Esperimento 17 dicembre 2014 Protocollo di irraggiamento Cellule CHO: monolayer non confluente su mylar Irraggiamento: protoni da 5 MeV (fascio verticale dell'acceleratore TOP-IMPLART) Range di dose: 1.0 – 6.0 Gy Dose rate: 2.5 Gy/min Fluenza: 106 particelle/cm2 Dose nominale (Gy) Dose misurata (Gaf) σ D 1,0 0,703 0,084 1,4 1,504 0,140 1,731 0,164 3,0 3,107 0,265 5,0 3,719 0,316 6,0 5,951 0,580 Per ogni dose nominale, è stata effettuata una misurazione della dose effettiva con pellicola di Gaf Cromico EBT3.

Protocollo del saggio di sopravvivenza cellulare Semina di 5x104 cellule CHO in 500 ml di terreno su dischi di mylar di 60 μm (d=16 mm) inseriti in cilindretti di acciaio 24h Irraggiamento Le cellule sono tripsinizzate, contate, diluite e piastrate per ottenere colonie da singola cellula (150-300 colonie per fiasca da 25 cm2) 6-7 gg Le cellule sono fissate e colorate in fiasca per la conta delle colonie (50 cellule/colonia) e la determinazione dell’Efficienza di Piastramento (PE = N°di colonie/N°di cellule piastrate) CHO chinese hamster ovary (morfologia di tipo epiteliale) – colonie formate da almeno 50 cellule/colonia –efficienza di Piastramento determinata per controlli e trattati

Calcolo della frazione di sopravvivenza cellulare (SF) SF: frazione di cellule che ha mantenuto la capacità clonogenica dopo il trattamento SF = PE trattato/PE controllo x100 Curva dose-risposta di sopravvivenza: fit dei dati sperimentali di SF vs dose con l’equazione lineare quadratica S(D)=exp(-αD-βD2) è stata valutata come rapporto percentuale tra la PE dei trattati vs la PE del controllo. S0 Exp(-a x -b x^2) S0 0,979 ± 0,078 α 0,087 0,067 ß 0,031 0,011   c2 = 1 n = 4 c2/n = 0

Confronto della curva di sopravvivenza con i dati di letteratura Tang et al, Br J Cancer (1997) Surviving fraction

Test del micronucleo Micronuclei (MN): appaiono nel citoplasma come piccoli nuclei accessori Sono formati da frammenti cromosomici o da interi cromosomi che non segregano correttamente alla divisione cellulare Indicatore diretto di rotture cromatidiche, rotture cromosomiche e danno aneugenico Frequenza di MN: valutazione del danno cromosomico Il test del micronucleo utilizza cellule in interfase che sono facilmente analizzabili in elevato numero e in breve tempo, permettendo un rapido screening di un'ampia popolazione cellulare. I micronuclei appaiono nel citoplasma come piccoli nuclei accessori, morfologicamente identici al nucleo principale ma di dimensioni ridotte. Possono essere formati da frammenti che, privi di centromero, non segregano correttamente alla divisione cellulare, o da interi cromosomi i quali, ritardano la migrazione anafasica, restando esclusi dai nuclei principali. Quindi i micronuclei rappresentano un indicatore diretto sia di rottura a livello cromosomico sia di alterazioni dell'apparato del fuso mitotico, e determinarne la frequenza significa valutare il danno cromosomico esistente. Poiché si ritiene che lo stadio ottimale per la visualizzazione dei MN (micronuclei) sia quello tra il completamento della divisione cellulare e la citodieresi, quando le cellule hanno un aspetto binucleato facilmente riconoscibile, si usa un agente denominato citocalasina B, sostanza estratta da un fungo, per bloccare le cellule senza interferire con la divisione nucleare o con l'integrità cromosomica. Aneugenico (che induce Aneuploidia) Capacità di una sostanza di indurre un’aberrazione cromosomica numerica caratterizzata dalla presenza di un numero dicromosomi diverso dal normale (aneuploidia). La monosomia e la trisomia rappresentano esempi di aneuploidi Freq: MN totali/ BN totali Cyt- B

Protocollo in situ per MN aggiunta di Cyt-b 20-24h di incubazione (37°C, 5% CO2) shock ipotonico fissaggio colorazione (Giemsa) Semina CHO su mylar 60μm ~ 3x104 cellule Irraggiamento p 5 MeV 24h Tutti i passaggi del protocollo sono eseguiti in situ nel cilindretto di irraggiamento Le caratteristiche del sistema di irraggiamento del PTB (irraggiamento su dischetti con una base di biofoil spessa 25 μm, possibilità di seminare e irraggiare al massimo 3000 cellule per dischetto in 3 o 4 mm diametro) ha richiesto lo sviluppo di uno specifico protocollo in situ per CA e MN. Questo protocollo è stato sviluppato su cellule CHO ed è un protocollo combinato che permette di visualizzare simultaneamente aberrazioni e micronuclei (eseguire il test del micronucleo e il test delle aberrazioni cromosomiche) sullo stesso campione. Avere il maggior nunero di informazioni sul singolo campione irraggiato 16 mm 13 mm 8

Ottimizzazione del protocollo sperimentale Adattamento del test in situ per MN alla superficie porosa di mylar Aspetti critici: Quantità di cellule da seminare su mylar Shock ipotonico Fissaggio Colorazione giusta densità con 104 cellule le fasi cruciali del test in situ sono state modificate per una visualizzazione ottimale delle cellule binucleate e MN su mylar

Protocollo MN in situ su mylar 40 X 20 X MN Protocollo MN in situ su mylar

Protocollo combinato (Progetto BioQuaRT) aberrazioni cromosomiche (CA) + micronuclei (MN) Colcemid MITOSI MN Dic Cyt-B Principio sul quale abbiamo lavorato per ottenere il massimo delle informazioni da un così esiguo numero di cellule è stato quello di sviluppare un protocollo combinato: le cellule vengono seminate da una piastra confluente (85-90% di cellule in G0-G1) Prevalutazione ciclo (G0,G1) Subito dopo l’irraggiamento viene aggiunta cyt-b e 3 ore prima del fissaggio viene aggiunto colcemid: 11

Protocollo MN + CA in situ BN BN MN M 2 M2 BN BN M1 Il protocollo combinato permette la lettura simultanea dei micronuclei e delle CA sullo stesso campione. Inoltre permette di distinguere le metafasi in prima divisione mitotica da quelle in seconda divisione molto semplicemente attraverso il numero di cromosomi. Questo protocollo combinato in situ èstato ideato e sviluppato inizialmente su vetrino, validato tramite una serie di irraggiamenti (raggi x) in cui è stato confrontato con i singoli protocolli per CA e MN eseguiti singolarmente (misura e confronto del danno indotto da radiazioni) Green arrows indicate metaphase in the first division Blu arrows indicate metaphases in the second division having a double number of chromosome Yellow arrows indicate binucleated cells M1 Protocollo MN + CA in situ CHO-K1 20x

RIASSUMENDO... Abbiamo ottenuto una curva di sopravvivenza confrontabile con i dati presenti in letteratura Stiamo adattando e ottimizzando il protocollo in situ per MN alle condizioni di irraggiamento presso l’acceleratore TOP-IMPLART Adatteremo alle condizioni sperimentali di TOP-IMPLART il protocollo combinato CA + MN. I nostri risultati sperimentali saranno confrontati con i dati ottenuti nell’ambito di BioQuaRT E abbiamo prodotto per la prima volta dati su aberrazioni cromosomiche in situ, indotte da irraggiamento con microbeam La tecnologia del “microbeam” a singolo ione ci ha permesso di misurare il danno cromosomico indotto cellula per cellula e di correlarlo con la qualità, l’energia della radiazione e il numero di particelle. Per scopi radioterapici

Grazie per l’attenzione!