Primers fluoriscinati 6-FAM: blu NED: giallo VIC: verde PET: rosso I primer sono marcati con 4 fluorocromi diversi che emettono fluorescenza ad una determinata lunghezza d’onda quando sono eccitati da un raggio laser
I Cinque Colori..... Quattro colori identificano i diversi marcatori Il quinto colore (arancione) identifica il ladder interno
A sample print -out for one person, showing all loci tested. Different colours help with interpretation
Esempio di tipizzazione
Ladder allelico
Medicina Legale
Medicina legale
Sequenziamento del DNA Metodo più accurato per ottenere informazioni precise e definitive sulla sequenza precisa di un tratto di DNA Metodo ideale per la rilevazione di mutazioni o polimorfismi (SNP) difficilmente evidenziabili e di mutazioni puntiformi DNA mitocondriale
Metodo di Sanger Il DNA da sequenziare è ottenuto come singolo filamento Si utilizzano dideossinucleotidi che sono privi dei gruppi ossidrilici in C-2 e C-3 ( nucleotidi terminatori) I dideossinucleotidi ( o i primers) sono marcati con isotopi radioattivi o con 4 diversi fluorocromi che marcano le 4 basi azotate del DNA Alla fine della reazione si ottiene miscela di reazioni parziali, terminate in qualunque posizione della catena nascente Si effettua un’elettroforesi capillare dei frammenti: la corsa dipenderà dalla loro dimensione
ACTGTCCTGAAT A* AC* ACT* ACTG* ACTGT* ACTGTC* ACTGTCC* ACTGTCCT*
Sequenza di DNA: omozigote normale
Sequenza di DNA: mutazione eterozigote