Qual è la funzione del gene?

DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE Come il DNA determina la sequenza delle proteine? Nel 1958 Crick formula il DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE Flusso unidirezionale dell’informazione genetica

Garrod e gli errori congeniti del metabolismo (1902) Archibald Garrod in “Inborn errors of metabolism”, notò che alcune malattie ereditarie umane sono dovute a mutazioni recessive che causano difetti metabolici. Fu il primo ad attribuire un ruolo biochimico alla funzione dei geni. Una di queste, la fenilchetonuria  è una malattia ereditaria metabolica causata da una mutazione recessiva autosomica nel gene PAH localizzato sul cromosoma 12 e codificante l'enzima fenilalanina idrossilasi. Ha frequenza di 1/15000 nati vivi. La fenilalanina idrossilasi trasforma l'amminoacido essenziale fenilalanina in tirosina. La mutazione causa una carenza di tirosina e accumulo di fenilalanina. Ridotti livelli di tirosina causano una diminuzione di molecole da essa derivate, come i vari neurotrasmettitori serotonina, adrenalina, noradrenalina, dopamina e il precursore della melanina, la DOPA. Inoltre, elevate concentrazioni di fenilalanina nel cervello possono essere “tossiche” e causare ritardo mentale variabile, ritardo nell'accrescimento e morte precoce.

Gli esperimenti di George Beadle e Edward Tatum (anni ‘40) Premio Nobel nel 1958

Le richieste auxotrofiche erano dovute a mutazioni in un singolo gene Beadle e Tatum utilizzando raggi X indussero diversi mutanti auxotrofi di Neurospora (es met-, arg-, gli- etc.) incapaci di crescere su terreno minimo Le richieste auxotrofiche erano dovute a mutazioni in un singolo gene

I mutanti difettivi nella sintesi di arginina Beadle e Tatum studiarono in particolare i mutanti auxotrofi per aminoacido arginina (arg-) e mapparono i geni selvatici corrispondenti Le mutazioni cadevano in tre diversi geni: arg1, arg2 e arg3 I mutanti arg1-, arg2- e arg3- rispondevano diversamente alla somministrazione di arginina, citrullina e ornitina. Ornitina e citrullina sono aminoacidi simili all’arginina

I mutanti difettivi nella sintesi di arginina Diversa risposta dei mutanti arg1-, arg2- e arg3- alla somministrazione di arginina, citrullina e ornitina i mutanti arg1- crescevano in presenza di arginina e anche in presenza di citrullina o di ornitina i mutanti arg2- crescevano sia in presenza di arginina che di citrullina i mutanti arg3- crescevano solo in presenza di arginina

All’epoca era già noto che all’interno della cellula la conversione delle sostanze fosse controllata dall’azione degli enzimi

Ipotizzarono inoltre che: In base alle caratteristiche chimiche degli aminoacidi e alla risposta in seguito alla somministrazione, Beadle e Tatum fecero le seguenti ipotesi: Esiste una via biosintetica che porta alla formazione di arginina a partire da un precursore Enzimi diversi controllano le varie tappe Ipotizzarono inoltre che: nei mutanti arg1 fosse difettivo l’enzima X che converte un precursore in ornitina nei mutanti arg2 fosse difettivo l’enzima Y che converte ornitina in citrullina nei mutanti arg3 fosse difettivo l’enzima Z che converte citrullina in arginina

Fornendo ai mutanti la sostanza a valle del blocco nella via biosintetica si ha la produzione di arginina precursore ornitina citrullina arginina enzima X enzima Y enzima Z arg1- arg2+ arg3+ precursore ornitina citrullina arginina enzima X enzima Y enzima Z arg1+ arg2- arg3+ precursore ornitina citrullina arginina enzima X enzima Y enzima Z arg1+ arg2+ arg3-

Ipotesi un gene-un enzima Sulla base di questi risultati, Beadle e Tatum formularono l’ipotesi “UN GENE UN ENZIMA” ovvero: i geni sono responsabili della produzione degli enzimi

Gli enzimi sono proteine Gli enzimi sono proteine. Le proteine sono macromolecole composte da amminoacidi legati in una struttura lineare H2N-CHR-COOH Esistono 20 aminoacidi ciascuno con un diverso gruppo R

I 20 Aminoacidi

Il legame peptidico

La determinazione della sequenza aminoacidica Frederick Sanger determina della sequenza dell’insulina bovina usando enzimi proteolitici che rompono i legami peptidici tra specifici aminoacidi (1953). Premio Nobel per la Chimica nel 1958 1) I frammenti ottenuti in seguito a digestione con enzimi proteolitici vengono separati mediante elettroforesi bidimensionale (su carta cromatografica) in solventi particolari in base alla loro velocità di migrazione 2) Sovrapponendo le corrispondenze nella sequenza dei vari frammenti si può determinare la sequenza completa della proteina

Anemia falciforme Nel 1949 Linus Pauling aveva dimostrato che l’Hb-S presente nei pazienti affetti da anemia falciforme migra diversamente dall’Hb-A in un’elettrofresi

Vernon Ingram determina la sequenza dell’emoglobina Nel 1957 determinò la sequenza aminoacidica dell’emoglobina normale e di quella alterata che è presente in pazienti omozigoti per il gene e che causa l’anemia falciforme Nell’emoglobina S in posizione 6 della beta-globina si trova valina al posto di acido glutammico It is astounding that the difference in structure is so small -- only about a dozen atoms out of 10,000 in the molecule are different," Pauling said in 1958, commenting on Ingram's findings.

I geni determinano la struttura primaria delle proteine Una mutazione in un gene produce la sostituzione di un singolo amminoacido sequenza di una catena polipeptidica I geni determinano la struttura primaria delle proteine Un gene – una catena polipeptidica

I vari livelli strutturali delle proteine

Colinearità tra gene e proteina Quale relazione esiste tra la sequenza lineare nucleotidica del gene e quella aminoacidica della proteina?? A metà degli degli anni ‘60 isolò mutanti di Escherichia coli incapaci di sintetizzare il triptofano. Mappò le mutazioni nel gene della triptofano sintetasiA e analizzò la sequenza aminoacidica dell’enzima triptofano sintetasiA presente nei vari mutanti confrontandola con l’ordine delle mutazioni mappate Charles Yanofsky La sequenza lineare dei nucleotidi di un gene determina la sequenza lineare degli amminoacidi nella proteina corrispondente

Colinearità tra gene e proteina Mediante trasduzione, Yanofsky produsse una mappa dettagliata delle mutazioni nel gene della triptofano sintetasi-A e determinò la sequenza aminoacidica dell’enzima codificato dai vari mutanti. A ogni singola mutazione nel gene corrispondeva una sostituzione di un singolo aminoacido in un punto specifico dell’enzima difettoso (come Ingram per l'emoglobina). L’ordine e la distanza delle mutazioni nel gene corrispondeva all’ordine e alla distanza degli amminoacidi mutati nell’enzima Dimostrò, quindi, una correlazione lineare tra la sequenza di siti mutanti nella mappa genetica del gene e quella dei corrispondenti aminoacidi alterati negli enzimi difettosi.

Colinearità tra gene e proteina Risultato analogo nel caso di mutazioni del gene che codifica la beta-globina umana Diverse emoglobine mutate sono il risultato di cambiamenti di un singolo amminoacido L’ordine delle mutazioni nel gene corrispondeva all’ordine degli amminoacidi mutati nella proteina

Da questi esperimenti si dimostrò la colinearità tra il gene e il suo prodotto proteico

Ciclo riproduttivo di neurospora