Elettrofisiologia e Biofisica di Membrana Laurea Magistrale in Neurobiologia Docente: Prof. Mauro Toselli mtoselli@unipv.it Potrete scaricare gli argomenti trattati a lezione al seguente indirizzo web: www.unipv.it/tslmra22 Foundations of cellular neurophysiology D. Johnston – S. M-S. Wu The MIT Press Durante il corso: una esercitazione obbligatoria Occorre fornire il proprio indirizzo di posta elettronica

Di cosa si occupa la Biofisica In questo corso ci occuperemo di biofisica della cellula con particolare riguardo alle cellule elettricamente eccitabili e a quei fenomeni in cui è coinvolta la membrana cellulare Questo corso è propedeutico al corso di Neurofisiologia cellulare (secondo semestre)

Equazione di Nernst Legge di Ohm Potenziale di Membrana Diffusione e flussi Trasporti mediati Equazione di Nernst Legge di Ohm Potenziale di Membrana

Perché parlare del concetto di diffusione? E’ una proprietà fisica fondamentale di tutti i processi biologici e costituisce il motore tramite il quale le cellule possono generare segnali

Qualche esempio È attraverso flussi diffusionali che molecole nutritizie e O2 passano dal sangue alle cellule dei vari tessuti. Un evento fondamentale che sta alla base del funzionamento dei neuroni, la genesi del potenziale d’azione, è prodotto dalla diffusione di ioni Na+ dentro la cellula nervosa. La trasmissione sinaptica, un evento fondamentale per la comunicazione neuronale, avviene per diffusione del neurotrasmettitore dal teminale pre-sinaptico di un neurone al terminale post-sinaptico di un altro neurone. La conoscenza della velocità di diffusione di un farmaco nell’organismo (farmacocinetica) fino al raggiungimento delle cellule bersaglio è fondamentale per la prescrizione del dosaggio.

Che cosa spinge le particelle a diffondere? La diffusione è il trasferimento di massa di singole molecole causato dal loro movimento casuale (generato dall’energia termica) ed associato ad un gradiente di concentrazione: moti browniani (A. Einstein) Che cos’è l’Energia Termica? Energia Termica (cinetica) = kT (u.d.m. joules) costante di Boltzmann 1.38x10-23 joules/oK temperatura assoluta 300oK a temperatura ambiente Nota: k · N (Numero di Avogadro) = R (costante dei gas) = P·V/T Che cos’è il Gradiente di Concentrazione? Rappresenta un cambiamento di concentrazione con la distanza (dC/dx)

Diffusione di Soluti F = d m dt 1 A Flusso Molare Unidirezionale: 1 2 Quantità di soluto (in moli) che attraversa un’area unitaria di una barriera nell’unità di tempo 1 2 [moli/(cm2·sec)] Dove: n=no particelle N= numero di Avogadro A=area t=tempo m rappresenta il numero di moli di soluto. dm/dt è la velocità alla quale m moli di soluto attraversano la sezione trasversa di riferimento (A). Questa velocità passerà da un valore zero iniziale ad un valore massimo dopo un certo tempo: da questo istante in avanti F non varierà più nel tempo ma diventerà costante cioè verrà raggiunto lo stato stazionario. Flusso netto: F = d m dt 1 A ·

COME VARIA LA CONCENTRAZIONE DI PARTICELLE CON LA DISTANZA? Il flusso è proporzionale alla pendenza della curva (che è il gradiente di concentrazione) La costante di proporzionalità è il coefficiente di diffusione (D) Prima Legge di Fick flusso µ d C dx = F - D C x xo barriera x Il segno negativo (-) davanti a D·dC/dx sta ad indicare che il flusso netto procede verso la zona a più bassa concentrazione, cioè . la direzione del flusso di soluto è da una regione a concentrazione più elevata ad una meno elevata di soluto. Il flusso è sempre una quantità positiva, dC/dx è sempre negativo. 1a legge di Fick – Dà il flusso allo stato stazionario, ovvero la velocità di diffusione attraverso un’area unitaria quando il gradiente di concentrazione (dC/dx) e quindi il flusso (FdC/dx) è costante, cioè NON varia più con la distanza. La diffusione cessa quando non c’è più un gradiente di concentrazione: dC/dx=0

Flusso F vs distanza x L’intensità del flusso diminuisce con un andamento iperbolico all’aumentare della distanza

= = cm = D s mol cm s mol cm mol D D cm 3 2 4 2 Qual’è l’unità di misura del coefficiente di diffusione (D) ? mol 3 mol cm mol = = D D · 2 · cm s 4 cm · 2 cm =   D s

Ovvero: F = (D/Dx)·DC F = DC Kd · · Allo stato stazionario il gradiente di concentrazione (dC/dx) è costante (relazione lineare tra concentrazione C e distanza x) e la 1a legge di Fick può essere scritta così: Ovvero: F = (D/Dx)·DC · F = DC Kd · NOTA sul raggiungimento dello STATO STAZIONARIO: Immaginando una membrana ideale che separa due compartimenti, e immaginando di poter rendere improvvisamente permeabile la membrana al soluto, la sua concentrazione all’interno della membrana sarà inizialmente zero, ma poi il soluto raggiungerà una concentrazione costante al suo interno. Da questo istante in avanti la concentrazione e quindi il flusso rimarranno costanti cioè, verrà raggiunto uno stato stazionario. Una importante condizione nella diffusione è quella allo stato stazionario La prima legge di Fick fornisce il flusso (o velocità di diffusione attraverso un’area unitaria) quando il flusso è allo stato stazionario (cioè quando dC/dt=0 (da non confondere con la condizione di equilibrio, che si instaura quando è nullo il gradiente di concentrazione, cioè quando dC/dx=0). Vedremo che la seconda legge di Fick si riferisce in generale ad un cambiamento di concentrazione nel tempo della sostanza diffusibile ad una qualunque distanza x (cioè, un flusso non stazionario). Il flusso F è direttamente e linearmente proporzionale al gradiente di concentrazione DC, e Kd= D/Dx

La seconda legge di Fick Le unità di misura del flusso sono: Ammontare di C per Area per Secondo; Dal momento che il flusso si sviluppa nel tempo, il risultante movimento di C causa un corrispondente cambiamento della sua concentrazione nel tempo t0 t1 t2 t3 Variazione della concentrazione nel tempo e del flusso nello spazio sono legati tra di loro. L’equazione della continuità è esprimibile come: La prima legge di Fick descrive le variazioni di concentrazione lungo una direzione (tre direzioni nel caso di un sistema tridimensionale), ma non fornisce informazioni sulle variazioni di concentrazione nel tempo. D’altra parte, dal momento che il flusso si sviluppa anche nel tempo, il risultante movimento di soluto causa un corrispondente cambiamento della sua concentrazione nel tempo. Dato un volumetto di spessore dx, la variazione della concentrazione di fluido nel tempo t, è evidentemente legata al flusso, F, di materia che attraversa lo spessore dx di quel volumetto. L’equazione della continuità è esprimibile nella seguente forma dC/dt=-dF/dx Tale equazione deriva dalla considerazione che la materia all’interno di un sistema non può essere né creata né distrutta, che corrisponde al principio di conservazione della materia. 2° legge di Fick – Si riferisce alla variazione della concentrazione del soluto nel tempo per ogni distanza “x”. Essa deriva dalla considerazione che la materia all’interno di un sistema non può essere né creata né distrutta (è il principio di conservazione della materia).   Ma, 1a legge di Fick : Quindi:

Raggiungimento dello stato stazionario all’interno della membrana o interfaccia Immaginando una membrana ideale che separa due compartimenti, e immaginando di poter rendere improvvisamente permeabile la membrana al soluto, la sua concentrazione all’interno della membrana sarà inizialmente zero, ma poi il soluto raggiungerà una concentrazione costante al suo interno. Da questo istante in avanti la concentrazione e quindi il flusso rimarranno costanti cioè, verrà raggiunto uno stato stazionario. Allo stato stazionario all’interno della membrana ideale non c’è nessun cambiamento nel tempo. La variazione di concentrazione nel tempo all’interno della lamina compresa tra x e x+Δx dipende dalla differenza tra i flussi in ingresso e in uscita dallo spessore Δx. La diffusione si ferma quando non c’è più gradiente di concentrazione: dc/dx=0 Tuttavia, dal momento che il flusso si sviluppa anche nel tempo, il risultante movimento di soluto causa un corrispondente cambiamento della sua concentrazione nel tempo. Dato un volumetto di spessore dx, la variazione della concentrazione di fluido nel tempo t, è evidentemente legata al flusso, F, di materia che attraversa lo spessore dx di quel volumetto.

Dm=F(x)ADt ‒ F(x+Dx)ADt Di quanto cambierà la concentrazione di soluto in questo elemento di volume nell’intervallo di tempo Dt? La variazione netta nella quantità di soluto all’interno della lamina (Dm), è data dalla differenza tra il flusso in ingresso (F(x)) e il flusso in uscita (F(x+Dx)), ciascuno moltiplicato per l’area A e l’intervallo di tempo Dt Dm=F(x)ADt ‒ F(x+Dx)ADt Dividendo questo per il volume della lamina, si ottiene la variazione in concentrazione: Ovvero, riarrangiando: Quando gli incrementi diventano infinitesimali, si ottiene l’equazione differenziale della continuità

“L’Equazione della Diffusione" Seconda legge di Fick “L’Equazione della Diffusione" Il tempo necessario affinchè ad una certa distanza dalla sorgente della diffusione, la concentrazione del soluto raggiunga un determinato livello, cresce col quadrato della distanza Allo stato stazionario: d2C/dx2=0 Domanda: La derivata di quale funzione è uguale a zero? Risposta: La derivata di una costante!  dC/dx=k  relazione lineare tra concentrazione C e distanza x (spessore della membrana) essendo dC/dx il coefficuente angolare dell’equazione della retta ΔC=kΔx

Tempo di diffusione vs distanza x Il tempo di diffusione di una molecola aumenta con il quadrato della distanza Altro esempio: Diffusione di un neurotrasmettitore nella fessura sinaptica: Fessura sinaptica=0.05 μm=5*10-6cm D per neurotrasmettitore≈10-5cm2/s t=1.25*10-6s=1.25 μs Quesito 1: quanto tempo impiega l’O2 a diffondere fino al centro di un’ameba se il raggio dell’ameba è x=0.01 cm? Risposta: t=x2/2D= 0.012cm2/2·10-5 cm2/s=5s Quesito 2: quanto tempo impiega l’O2 a diffondere fino al centro di un topo se il raggio del topo è x=2 cm? Risposta: t=x2/2D= 22cm2/2·10-5 cm2/s=200000s= 56 ore

Condizioni al contorno: (1.) la concentrazione è finita ovunque. Per risolvere quest’equazione differenziale occorre specificare una condizione iniziale e due condizioni al contorno, quindi essa ha più soluzioni diverse, Condizione iniziale: a t=0 tutte le No particelle sono concentrate nell’area (A) Condizioni al contorno: (1.) la concentrazione è finita ovunque. (2.) il numero totale di particelle (N0) è costante. allora la soluzione sarà: Cioè, se per percorrere una distanza di 1 mm la particella impiega 2 sec, per percorrere una distanza tripla (3 mm) il tempo impiegato non sarà 1x3 sec ma: (1x3)2 sec = 9 sec Inoltre, essendo: sarà:

La relaziomne tra concentrazione (C) e distanza (x) è simmetrica rispetto all’origine per valori positivi e negativi di x Ciascuna linea è un’istantanea del profilo spaziale della concentrazione in funzione della distanza a tempi diversi dalla partenza del processo diffusivo 0.4 -0.4 0.8 -0.8 -1.2 1.2 Distanza (x) C Distanza (x) 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 Concentrazione (C) 0.05 = Dt 0.1 0.3 1.0 Mostra il profilo spaziale della concentrazione ad un tempo fisso Si tratta di una curva di Gauss (distribuzione normale) Quando il sistema và all’equilibrio, la concentrazione diviene uguale in ogni punto x (costante)

animazioni Diffusione attraverso una membrana aspetti quantitativi animazioni Rappresentazione grafica del processo di diffusione

Diffusione attraverso una membrana la concentrazione di soluto varia nel tempo con un andamento esponenziale Est. (o) Int. (i) 37% di (co - c∞)+ c∞ = 143 ceq=110 37% di (c0-cinf)=(37(200-110)+110=143 63% di (cinf-c0)=63(110-20)+20=77 63% di (c∞- co) + co= 77 t

Diffusione di un soluto attraverso una membrana Lato est. Lato int. Vo Vi Assumiamo: - Vi e Vo sono costanti - i bagni sono ben mescolati - vale il principio di conservazione della materia e la membrana è sottile: ciVi+coVo=N - la membrana si trova sempre allo stato stazionario: F=P(ci-co) (P≡perm. della membr. al soluto) Da: !!! Lec04-fig membrane diffusion.pdf

Problema: per quale valore di C(t) risulta essere t=t? 63% di C∞-Co C∞ C∞-Co Co tempo Problema: per quale valore di C(t) risulta essere t=t? Vogliamo dimostrare che quando t=t, C(t) è il 63% di C∞ Numero di Nepero: e= 2.7183…. C(t)=C∞+(Co-C∞)·e-t/t Per t=t  (C(t)=C∞+(Co-C∞)·1/e Per Co=0 e C∞=1  C(t)=1-1/e=1-0.37=0.63 Cioè, C(t) è il 63% del valore finale (C∞) meno il piedistallo iniziale (Co)

Una membrana costituita da un puro bilayer fosfolipidico è impermeabile alle proteine, alla maggior parte delle piccole molecole e agli ioni Gas Etanolo Piccole molecole polari non cariche Acqua Urea Grosse molecole polari non cariche Glucosio Ioni Molecole polari cariche Aminoacidi ATP Glc-6-P

Passaggio attraverso la membrana di particelle mediante proteine di trasporto

Caratteristiche dei trasporti mediati I carriers sono dotati di specificità Sono soggetti a saturazione Possono essere bloccati dagli inibitori competitivi Hanno un’elevata dipendenza termica e dal pH

I trasportatori hanno le caratteristiche di enzimi I carriers agiscono cataliticamente come gli enzimi Legano selettivamente il loro substrato, cioè la molecola che deve essere trasportata Cambiano di conformazione per rilasciare il substrato dall’altro lato Ritornano alla conformazione originale per legare un’altra molecola di substrato Seguono una cinetica del tipo Michaelis-Menten

Analisi cinetica del transporto di una molecola tramite proteina carrier: saturazione In base alla Ia legge di Fick il flusso di particelle che diffondono liberamente aumenta linearmente all’aumentare della concentrazione Ma la Ia legge di Fick non viene più rispettata se si tratta di un flusso di particelle attraverso la membrana mediato da carriers Fmax 10 20 30 100 200 300 F D C F=kdDC 50 100 150 200 5 10 15 20 Flusso netto [moli/(cm 2 × s] D C (mM) 104 I flussi mediati da carriers -a differenza della diffusione libera - sono saturanti Ciò accade per due motivi: Sulla membrana è presente un numero finito di carriers; Ciascun carrier opera ad una velocità finita

Rappresentazione del concetto di saturazione con un esempio numerico Velocità del carrier: 50 part./s Per semplicità consideriamo una membrana con un solo carrier 800 1000 10 20 30 40 50 Flusso (Particelle/Carrier/s) N. particelle N. partic. Vel. (p./s) 1 100

Come sono stati ottenuti i dati del grafico che illustra come varia il flusso al variare della concentrazione? Flusso netto [moli/(cm 2 × s] C (mM) 20 40 60 80 100 5 10 15 C1 ? Cellule in sospensione C1 F1 Si introduce nella provetta il substrato S radioattivo ad una concentrazione C1 A tempi successivi (t0, t1, t2, t3, …) si preleva un campione dalla provetta e si misura la concentrazione di S radioattivo all’interno delle cellule del campione 10 20 30 40 50 1 2 3 4 5 [S] in Tempo pendenza della retta º Dividendo la velocità v1 per l’area della membrana si ottiene il primo valore del flusso F1 riferito alla concentrazione C1 (vedere definizione di flusso)

C4 F4 Flusso netto [moli/(cm 2 × s] D C (mM) 20 40 60 80 100 5 10 15 C3 F3 Successivamente si introduce in ciascuna provetta substrato S radioattivo alle altre concentrazioni C2, C3, C4 …. crescenti e si ripete la stessa procedura descritta precedentemente C2 F2 C1 F1 C2 C3 C4 V4F4 10 20 30 40 50 [S] in Tempo V3F3 V2F2

I carriers, come gli enzimi, possono essere soggetti ad inibizione competitiva Fmax 50 100 150 200 5 10 15 20 Flusso netto [moli/(cm 2 × s] D C (mM) 104 + Ic + Ic

Come funziona un inibitore competitivo? .001 10 .01 Prob [Ic] [S] solo S S << Ic S >> Ic .010 10 .1 .091 10 1 substrato Inibitore comp. .5 10 .909 10 100 .990 10 1000 .999 10 10000 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 5 15 20 Flusso [S] Se si vuole costruire un grafico che rappresenti un range di concentrazioni molto ampio (alcuni ordini di grandezza) conviene rappresentare le concentrazioni in scala logaritmica S S+Ic

In presenza di Ic il valore di Fmax non cambia Varia invece la ka Calcolo della costante di affinità ka 50 100 150 200 5 10 15 20 Flusso netto [moli/(cm 2 × s] D C (mM) 10 20 30 5 15 Flusso netto [moli/(cm 2 × s] D C (mM) ka1 ka2 ka3 ka è quel valore di concentrazione del substrato al quale il flusso è la metà di quello massimo ka è inversamente proporzionale all’affinità del carrier per il substrato

Quesito del giorno Un ricercatore trova che la velocità con cui una sostanza è trasportata all’interno di certe cellule varia al variare della sua concentrazione come illustrato in tabella. Trovare i corrispondenti valori di flusso sapendo che l’area di membrana su cui sono state fatte le misure è 3·10-2 cm2; Rappresentare graficamente i valori del flusso al variare della concentrazione di substrato in due grafici distinti ove le concentrazioni sono rappresentate rispettivamente in forma lineare e logaritmica; Ricavare dal grafico i valori di Fmax e ka. Conc. mM v (mmol/s) 1 10.0 5 16.7 10 18.2 20 19.0 30 19.4 50 19.6 100 19.8 200 19.9 0.1 3.0

Risposta al quesito 50 100 150 200 300 400 500 600 700 mmoli/s/cm 50 100 150 200 300 400 500 600 700 mmoli/s/cm 2 Concentr. 0.01 0.1 1 10 100 200 300 400 500 600 700 mmoli/s/cm 2 Concentr.

Quesito su cui meditare Bloccando irreversibilmente con un farmaco la metà dei carriers sulla membrana, Fmax rimarrebbe inalterata, aumenterebbe o diminuirebbe? Questo corrisponde al caso di un inibitore non competitivo o allosterico Il legame di un inibitore allosterico all'enzima (trasportatore),in un sito diverso dal sito attivo, genera un cambiamento conformazionale dell'enzima (trasportatore) stesso, che può avere come conseguenza l'inibizione del legame tra enzima (trasportatore) e substrato. Non essendoci dunque competizione tra inibitore e substrato, verrà modificato Fmax ma NON Ka..

Migrazione in un campo elettrico C’è un flusso netto di cationi (K+) verso il catodo (polo -) e di anioni (Cl-) verso l’anodo (polo +) è la pendenza del gradiente elettrico La costante di proporzionalità dipende dalla mobilità e dalla concentrazionedel soluto ovvero:

Una differenza di cariche (Δq) ovvero di potenziale elettrico (ΔV) ai due capi della membrana influenza il movimento degli ioni cariche - cariche + Anioni Cationi Citoplasma Spazio extracell. { membrana Quindi, il flusso di particelle cariche dipende non solo dal gradiente di concentrazione ma anche dal gradiente elettrico Equazione di Nernst-Planck:

Equazione di Nernst Permette di calcolate il potenziale di equilibrio di una specie ionica note le sue concentrazioni all’equilibrio a cavallo della membrana

Distribuzione di Maxwell-Boltzmann E' una legge sperimentale che rappresenta il numero (o frazione) di particelle Nu che possiedono una certa energia u, in funzione dell'energia stessa u: cioè ad ogni valore di energia (a una data temperatura T) corrisponde un numero definito di particelle con quella energia. 1 Nu/N T1 T1 < T2 < T3 < T4 All’aumentare della temperatura, aumenta la frazione di molecole con energia cinetica maggiore dell’energia di attivazione, l’area sottesa alla curva, a destra dell’energia di attivazione, è una misura della frazione di popolazione di molecole con Ec  Ea 0.5 frazione di molecole aventi energia cinetica u Energia di attivazione T2 Ogni curva di distribuzione ha la forma di una campana irregolare e asimmetrica. Per T1 < T2<T3<T4 la maggior parte delle molecole è distribuita in un intervallo più ridotto di u: poche molecole perciò potranno avere u sufficiente per superare la barriera energetica necessaria affinchè una certa reazione avvenga. All'aumentare della T aumenta il numero di molecole con u sufficiente a superare la barriera dell’energia di attivazione, perciò aumenta la velocità della reazione. Le aree sottese dalle due curve sono eguali poiché rappresentano lo stesso numero totale di particelle N T3 T4 energia cinetica u

Equazione di Boltzmann L’equazione di Nernst è ricavabile dall equazione di Boltzmann della meccanica statistica Equazione di Boltzmann Mette in relazione le probabilità di una particella (frazione di particelle) di trovarsi nello stato energetico  o nello stato energetico  con le differenze di energia u2-u1=Du tra i due stati: k  cost. di Boltzmann T  temp. assoluta u2-u1=DG variaz. di energia libera (joules) Stato 1 Stato 2 Energia D u Il rapporto P2/P1 corrisponde alla costante di equilibrio della reazione. La barriera energetica che le particelle in 1 devono superare per passare a 2 è più bassa di quella che devono superare le particelle in 2 per passare ad 1. Quindi la transizione 1 → 2 sarà favorita rispetto a quella 2 → 1. Questo è il motivo per cui troviamo più particelle nello stato 2 che nello stato 1. La particella spende il minor tempo nello stato ad energia maggiore

La probabilità delle particelle di trovarsi nello stato 2 rispetto allo stato 1 diminuisce all’aumentare del livello energetico dello stato 2 (u2) u1 1 kT= 20 u2 P2/P1 1.051 1.000 6 0.779 11 0.607 16 0.472 21 0.368 26 0.287 31 0.223 36 0.174 41 0.135 46 0.105 51 0.082 56 0.064 61 0.050 66 0.039 71 0.030 76 0.024 81 0.018 86 0.014 91 0.011 96 0.009 101 0.007

che è l’equazione di Nernst! Passando dalle probabilità P (o frazione di particelle) alle concentrazioni c e dall’energia di una singola particella u all’energia molare U, si ottiene: R  cost. dei gas (R=k·N, Nno di Avogadro) U2-U1=Dm è l’energia molare (potenziale chimico) ed espressa in joules/mole ovvero: c1 c2 Nel caso di particelle elettricamente cariche, se U2-U1 è la differenza di potenziale elettrochimico molare di uno ione permeante, dovuta non solo alla differenza di potenziale chimico, anche alla differenza di potenziale elettrico V2-V1, e se la carica dello ione è z, allora: All’equilibrio U2-U1=0: che è l’equazione di Nernst! All’equilibrio chimico: U2-U1=-RTln(c2/c1)=0 Ovvero: U2=U1 Ovvero RTln(c2/c1)=0 ovvero ln(c2/c1)=0 quando accade questo? Quando c2=c1 e quindi C2/c1=1 infatti, ln(1)=0 Per U2>U1 C2/C1<1  C2<C1 Per U2<U1  C2/C1>1  C2>C1 Infatti l’esponenziale di un numero negativo è compreso tra 0 e 1 Mentre l’esponenziale di un numero positivo è maggiore di 1

Quando si applica l’equazione di Nernst: membrana permeabile ad almeno una specie ionica ed impermeabile ad almeno un’altra + - + - K+ K+ K+ K+Cl- 100 mM Na+Cl- ΔC ΔE ΔC ΔE ΔC ΔE All’equilibrio: flusso dovuto al gradiente di conentrazione = flusso dovuto al potenziale elettrico Si tratta di un equilibrio elettrochimico: Equilibrio di Donnan

Equilibrio di Donnan to t1 t2 All’equilibrio, applicando fusso dovuto al gradiente di concentrazione fusso dovuto al gradiente elettrico La lunghezza delle frecce indica l’intensità dei flussi All’equilibrio, applicando l’equazione di Nernst sarà: Ovvero: (Equazione di Donnan)

[K+]2+[Cl-]2>[K+]1+[Cl-]1 Conseguenze: Viene prodotta una differenza di potenziale transmembranaria ΔV stabile nel tempo; La concentrazione totale degli ioni diffusibili (K+ e Cl-) è maggiore dal lato dove si trova lo ione non diffusibile (Pr-): [K+]2+[Cl-]2>[K+]1+[Cl-]1 DA MEDITARE Riferendoci all'esempio dell'equilibrio di Donnan illustrata in figura, se la somma algebrica delle cariche positive e negative in ciascuna delle due soluzioni che bagnano la membrana è nulla, cioè se nel compartimento 1 si ha che [K+]1 = [Cl-]1 e nel compartimento 2 si ha che [K+]2= [Cl-]2 + [Pr-], è legittimo chiedersi dove si verifichi la separazione di ioni di segno opposto che rende positivo il compartimento 1 e negativo il compartimento 2. La risposta esauriente a questa domanda richiede una trattazione che faccia ricorso a principi più generali di quelli utilizzati finora. Con un'analisi basata sulla distribuzione di Boltzmann (uno dei cardini della meccanica statistica), si può dimostrare che la separazione di ioni di segno opposto non avviene nelle soluzioni che bagnano la-membrana, ma solo all'interno delta membrana e quindi in un mezzo che, pur consentendo il passaggio degli ioni,è ben diverso come natura dalle soluzioni acquose. Questa analisi ha permesso di stimare che all'interno del1a membrana l'eccedenza degli ioni di un segno rispetto a quelli di segno opposto è limitata a due strati di 10-15 A di spessore, localizzati ai lati di una superficie ideale che si può immaginare tagli a metà lo spessore della membrana reale; qui in effetti e localizzata la "giunzione elettrica" tra le soluzioni che si trovano nei due compartimenti. Riferendoci al caso illustrato in figura, ad esempio, si può stimare che la prevalenza statistica a degli ioni K+ sugli ioni Cl- sia limitata al sottilissimo strato di membrana rivolto al versante 1, e che nello strato ugualmente sottile che guarda il versante 2 gli ioni Cl- siano statisticamente prevalenti sugli ioni K+ . Occorre comunque precisare che la quantità di ioni "in eccesso" o "in difetto" nei due strati e estremamente piccola se confrontata con il normale contenuto ionico dei liquidi organici (*). L 'esiguità di questa quantità consente di affermare che il principia dell'elettroneutralità delle soluzioni, almeno da un punto di vista macroscopico non è violato dall’esistenza del potenziale di membrana. 1 (*) Questa quantità può essere facilmente calcolata considerando la membrana come un condensatore, e dividendo la "carica" elettrica della membrana, espressa in Coulomb (Q), per il numero di Faraday (9,6·104). Ad esempio, per una membrana cellulare che abbia un potenziale di membrana di 80 mV e una capacita specifica di 1 mF/cm2, si avrà che ogni cm2 separa una carica di: Q = 10-6 · 8·10-2 = 8·10-8 (Farad) (Volt) (Coulomb) Quindi la quantità di cationi "in eccesso" sui versante positivo della membrana sarà, .per ogni cm2: 8·10-8/9.6·104 =ca. 10-12 Moli Vi è un aumento di pressione osmotica dal lato dello ione non diffusibile

Potenziali di equilibrio dei vari ioni in alcuni tipi di cellule In tutte le cellule c’è una differenza di potenziale a cavallo del plasmalemma stabile nel tempo (pot. di riposo) Potenziali di equilibrio dei vari ioni in alcuni tipi di cellule conc.extracell. (mM/litro) 20 440 560 2.5 120 5 145 110 conc.intracell. (mM/litro) 400 50 40 139 20 3.8 140 5 4 pot. di Eq. (mV) -75 +55 -66 -102 +45 -88 -90 +91 -89   Cellula Assone gigante di Calamaro Fibrocellula muscolare di Rana Neurone di Mammifero  ione K+ Na+ Cl- Cl—

Domanda molto pertinente: visto che il PR si mantiene costante nel tempo (e così pure le concentrazioni ioniche), si può dire che a cavallo della membrana sussiste un equilibrio elettrochimico ? La risposta è NO Infatti, il PR non coincide col potenziale di equilibrio (potenziale di Nernst) di alcuna delle specie ioniche presenti. A 18°C …. conc.extracell. (mM/litro) 20 440 560 2.5 120 5 145 110 conc.intracell. (mM/litro) 400 50 40 139 20 3.8 140 5 4 pot. di Eq. (mV) -75 +55 -66 -102 +45 -88 -90 +91 -89 RP (mV)   -70 -90 -80   Cellula Assone gigante di Calamaro Fibrocellula muscolare di Rana Neurone di Mammifero  ione K+ Na+ Cl- Cl—

Quando si genera un potenziale di diffusione: Si genera quando la membrana è permeabile in misura diversa alle varie specie ioniche K+Cl- 100 mM Na+Cl- 1 2 1 2 1 2 + - + - K+ Na+ K+ Na+ t1 t2 pK>pNa fK>fNa fK=fNa pK>pNa Il suo raggiungimento comporta: Equilibrio elettrico ma squilibrio elettrochimico Flusso netto non nullo delle varie specie ioniche Un potenziale di diffusione non si mantiene indefinitivamente

GENESI DEL POTENZIALE DI MEMBRANA K + Na+ Cl- Il potenziale di membrana è una conseguenza di una permanente differenza di concentrazione ionica ai due capi della membrana Questa è prodotta da: una membrana permeabile in maniera selettiva ma con valori diversi di permeabilità a diverse specie ioniche (potenziale di diffusione) flussi passivi e attivi degli ioni permeanti

che è derivata dall’equazione di Nernst-Plank per i flussi: Se il potenziale di membrana Vm è dovuto ad un potenziale di diffusione, esso non coinciderà con nessuno dei potenziali di equilibrio delle specie ioniche permeanti (Vm ≠ Ei). In questo caso, invece dell’equazione di Nernst vale la seguente equazione: Equazione di Goldman-Hodgkin-Katz (GHK) per il Voltaggio V m = R T F l n P K + [ ] O N a i æ è ç ö ø ÷ Cl C - che è derivata dall’equazione di Nernst-Plank per i flussi: Qualora la membrana fosse permeabile solo al K+ (cioè PNa=0 e PCl=0): V m = R T F l n P K + [ ] O i æ è ç ö ø ÷ E

Quesito Ione Citoplasma Extracell. (mM) Na 10 120 K 3 + 10 120 K 3 In base ai dati indicati in tabella e sapendo che la membrana è permeabile a Na e K con il seguente rapporto di permeabilità: PK : PNa = 10 : 1, calcolare il potenziale di membrana Vm applicando l’equazione di GHK. Confrontare il valore trovato con quello che si otterrebbe se PK:PNa=1:1. PK:PNa=10:1 PK:PNa=1:1

Ciò semplifica la trattazione dei fenomeni bioelettrici di membrana È possibile costruire un modello circuitale elettrico equivalente della membrana Ciò semplifica la trattazione dei fenomeni bioelettrici di membrana

A questo punto, però, sarà bene andare a ripassare le principali leggi che regolano i circuiti elettrici e i principali elementi passivi che li costituiscono

Definizione di potenziale elettrico A ha un potenziale elettrico più elevato di B se connettendo A e B con un conduttore una corrente positiva fluisce da A a B La convenzione standard per il potenziale di membrana è: Em= (Ψe-Ψi) Ψi Ψe Potenziale del bagno Potenziale intracellulare La convenzione standard per la corrente di membrana è: cariche (+) che si muovono fuori dalla cellula generano una corrente positiva +Im -Im

Il gradiente di concentrazione dell’Na+ è orientato in modo da mandare cariche positive nella cellula qualora l’Na+ possa passare Da un punto di vista elettrico ciò equivale a dire che esiste una batteria al Na+ con un determinato orientamento Est Int ENa + gNa = 0 Nonostante esista un gradiente di concentrazione dell’Na+, cioè una batteria al Na+, per il momento non c’è flusso di corrente perché il canale del Na+ è per ora chiuso! Cioè, da un punto di vista circuitale ciò equivale a dire che per il momento il circuito è aperto

+ - + ENa gNa Est Int ENa gNa + In seguito all’apertura del canale selettivo per il Na+ vi sarà un flusso di corrente (INa) generato dal gradiente di concentrazione dell’Na+, cioè dalla batteria al sodio ENa L’intensità del flusso di corrente INa dipenderà, oltre che dall’intensità della batteria al Na+ (ENa), anche dalla resistenza che il canale offrirà al passaggio degli ioni Na+ gNa + ENa ENa + gNa + - Nota circa la polarità della batteria al Na: in un circuito la corrente scorre dal punto a potenziale maggiore (polo +) al punto a potenziale minore (polo -). Nello schema, dove il Na è più concentrato fuori (potenziale più elevato) la corrente (di Na) scorre da sinistra (fuori) a destra (dentro) Est Int La permeabilità del canale nei confronti dello ione può essere rappresentato da un punto di vista elettrico con un resistore RNa ovvero con il suo inverso la conduttanza gNa

Pertanto, un canale e il gradiente di concentrazione dello ione permeante che lo attraversa possono essere rappresentati da un punto di vista elettrico come costituiti rispettivamente da un resistore e da una batteria in serie Se sulla membrana esistono più canali ciascuno selettivo per un certo ione, il circuito elettrico equivalente sarà del tipo: esterno interno K+ Na+ Cl- ENa gNa gK gCl EK ECl Questo circuito simula una concentrazione di Cl più elevata intracellularmente.

Pertanto il potenziale di membrana sarà: Si è visto che un potenziale di diffusione si genera quando la membrana è permeabile in misura diversa ad almeno due specie ioniche, ad es. Na+ e K+ Vm D’altra parte la membrana plasmatica con il suo corredo di canali ionici e di ioni diversamente concentrati ai suoi lati, è assimilabile ad un conduttore elettrico dotato di batterie e resistori Nell’esempio a lato il circuito simula una membrana dotata di canali selettivi per K+ e Na+ K+Cl- Na+Cl- Extra Intra ENa gNa EK INa IK E’ possibile applicare la legge di Ohm ad ogni maglia del circuito: Ii = gi·(Vm-Ei) dove: gi ≡ conduttanza della membrana per lo ione i (Vm-Ei ) ≡ d.d.p. elettrochimico che muove lo ione i (driving force) Studiando il potenziale di diffusione abbiamo visto che a un certo istante il flusso di K+ è uguale e contrario al flusso di Na+, ovvero la somma delle correnti IK e INa è nulla: equilibrio elettrico  INa+ IK = 0 Quindi: Pertanto il potenziale di membrana sarà:

Quesito del giorno Dati: Trovare: 1) ENa=+55mV; EK= -90mV; gNa=22mS; gK=55mS; gCl=0 Vm=….. 2) Vm= -30mV; ENa=+50mV; EK= -70mV; gNa=10mS; gCl=0 gK=….. 3) ENa=+62mV; EK= -90mV; ECl= -92mV; gNa=20mS; gK=50mS; gCl=20 mS Vm=…..

Risposte 1 2 3

Problema In seguito all’arrivo di un quanto di neurotrasmettitore, che attiva un certo numero di recettori-canale a livello di un terminale postsinaptico, viene generato un potenziale postsinaptico di -0.24 mV. Se a livello del terminale postsinaptico il potenziale di membrana prima dell’arrivo del neurotrasmettitore era di -80 mV, la conduttanza di un singolo recettore-canale è di 30 pS, il potenziale di equilibrio dello ione permeante attraverso il recettore-canale è di 0 mV e la resistenza d’ingresso della cellula a livello del terminale postsinaptico è di 1MW, stabilire quanti recettore-canali vengono attivati durante la genesi di quel potenziale post-sinaptico. La resistenza d’ingresso (Ri) di una cellula è la resistenza complessiva che la membrana offre al passaggio di corrente, e quindi ad una variazione del potenziale. Essa è misurabile applicando una differenza di potenziale nota ai due capi della cellula e andando a misurare la corrente transmembranaria, oppure iniettando una corrente nota nella cellula e andando a misurare la differenza di potenziale generata ai due capi della membrana.

i = g·(Vr-Veq) = 30·10-12·(-80·10-3) A = -24·10-13 A = -2.4 pA Soluzione Dati del problema: DVPPS = -0.24 mV g = 30 pS Vr = -80 mV Veq = 0 mV Ri = 1 MW Calcoliamo innanzi tutto la corrente che attraversa un singolo recettore-canale: i = g·(Vr-Veq) = 30·10-12·(-80·10-3) A = -24·10-13 A = -2.4 pA Ricordiamo che la resistenza d’ingresso (Ri) di una cellula è la resistenza complessiva che la membrana offre al passaggio di corrente, e quindi ad una variazione del potenziale. Essendo quindi Ri, secondo la legge di Ohm, uguale al rapporto tra la differenza di potenziale generata ai due capi della membrana e la corrente totale che attraversa la membrana, avremo che: DVPPS = Itot·Ri = n·i·Ri Dove n=numero di recettoric-canale e i=corrente di singolo canale e quindi, n = DVPPS /(i·Ri) = -0.24·10-3/(-24·10-13 ·1·106) = 100

Assone di calamaro Concentrazione in millimoli/l, potenziale in millivolts.

Neurone di Mammifero Concentrazione in millimoli/l, potenziale in millivolts. Il Ca è fortemente tamponato; pertanto la concentrazione interna totale di Ca è più alta

FINE