Funzioni di Oncogèni Geni la cui accresciuta e non regolata attività favorisce la crescita tumorale Principali oncogèni  Fattori di crescita (GF) sis catena B di PDGF (Platelet derived growth factor) int-2 FGF-basico (Fibroblast growth factor) wnt fattore di crescita WNT, prec INT-1  Recettori di fattori di crescita di membrana (tirosin chinasi) erbB1 EGF-R (Epidermal growth factor-Receptor) erbB2 neu, HER-2, tirosin chinasi di membrana fms CSF-1R (Colony stimulating factor-1-Receptor) kit SCF-R (Stem cell factor-Receptor) met HGF-R (Hepatocyte growth factor-Receptor) ret recettore di GDNF (Glial derived neurotrophic factor) trk-A recettore di NGF (Nerve growth factor) recettori nucleari erbA recettore ormoni tiroidei

Funzioni di Oncogèni src tirosin chinasi abl tirosin chinasi  Trasduttori del segnale src tirosin chinasi abl tirosin chinasi ras GTP-asi (proteina G)  Fattori trascrizionali myc jun fos  Regolatori positivi del ciclo cellulare CCND ciclina D CCDK4 chinasi ciclina-dipendente 4 Inibitori di apoptosi bcl-2

Oncogèni/Protooncogèni e tumori La scoperta degli oncogèni (fine anni ‘70-inizio anni ’80) è nata da 2 osservazioni: ● in retrovirus oncogeni sequenze geniche responsabili della trasformazione neoplastica erano omologhe a sequenze del normale genoma cellulare ● sequenze geniche di tumori trasformavano in senso neoplastico cellule normali

Oncogèni/Protooncogèni e tumori oncogèni virali (v-onc) = analoghi alterati di geni cellulari (c-onc) rimasti inseriti nel genoma virale in seguito ad una infezione Nel genoma i geni cellulari che, se alterati nella struttura o nella espressione (attivati), diventano oncogèni venivano chiamati protooncogèni Comunemente si usa il termine oncogèni anche per i protooncogèni non attivati, normalmente regolati.

Meccanismi di attivazione di Oncogèni Meccanismi che determinano alterazioni nella struttura o espressione di oncogèni tali che favoriscono crescita tumorale  Mutazione puntiforme  Amplificazione  Traslocazione  Mutagenesi inserzionale  Meccanismi Epigenetici

Meccanismi di attivazione di oncogèni Mutazione puntiforme porta a un prodotto alterato (livelli aumentati, molecola più attiva, molecola meno inibita) es. RAS carcinomi (H-RAS, K-RAS), alcune leucemie (N-RAS) Amplificazione (centinaia di copie) porta a un prodotto normale ma iperespresso N-MYC Neuroblastoma, microcitoma polmonare ERB-B1 Glioblastoma multiforme ERB-B2 Carcinoma della mammella, ovaio MET Carcinoma gastrico, colon Ciclina D Carcinoma mammella

Meccanismi di attivazione di oncogèni Traslocazione • porta a un prodotto normale, ma iperespresso es. MYC Linfoma di Burkitt t(8;14) • porta a una proteina chimerica (più attiva) es. ABL Leucemia mieloide cronica t(9;22) cromosoma Philadelphia BCR-ABL proteina chimerica

Meccanismi di attivazione di oncogèni altre modalità di attivazione Mutagenesi inserzionale Retrovirus trasformanti “lenti”, ad es. MMTV provoca carcinoma mammario topo perché promotore virale attiva oncogèni (oncogèni int) qualche caso anche nell’uomo (T.G.) Epigenetica es. perdita di imprinting (LOI) di IGF-II porta a iperespressione nel rabdomiosarcoma

Effetti degli oncogèni attivati ● Fattori di crescita Aumento dei livelli del fattore di crescita e Diminuita dipendenza della cellula da apporto esterno di fattore di crescita. Autocrinia es. sis catena B di PDGF Iperespresso nell’astrocitoma - Autocrinia

Effetti degli oncogèni attivati ● Recettori di fattori di crescita Aumento dei livelli e maggiore suscettibilità della cellula a livelli di fattori di crescita fisiologici Indipendenza dal ligando Prodotto più duraturo erbB1 EGF-R Iperespresso (amplificato) ca mammario. Deleto dominio extracellulare nel glioblastoma: indipendente dal ligando erbB2 tirosina chinasi di membrana Iperespresso (amplificato) ca mammario kit SCF-R Mutazione puntiforme e piccole delezioni Iperespresso sarcomi gastrointestinali, leucemia mieloide

Effetti degli oncogèni attivati ● Trasduttori del segnale Aumento dei livelli del trasduttore Prodotto più duraturo o attivo ras GTP-asi (proteina G) ancorata al versante citoplasmatico della membrana Mutazione 10-20% dei tumori rende difficile la sua inattivazione

RAS Via delle MAP chinasi Il legame al recettore tirosin chinasico provoca dimerizzazione del recettore, autofosforilazione, legame a proteine adattatrici come GRB2 e SOS attivazione della proteina RAS p21ras , proteina ad attività GTPasica ancorata alla membrana Nella sua forma inattiva RAS lega il guanosin-difosfato (GDP). dopo essere stata attivata la proteina rilascia il GDP per legare il GTP L’attivazione di RAS è contrastata da proteine con attività GAP (GTPase activating protein) che promuovendo l’idrolisi del GTP riconduce RAS allo stato inattivo, legato al GDP.

RAS RAS attivata lega la proteina RAF (anch’essa ancorata alla membrana) che lega e fosforila MEK (una MAP chinasi), ERK (altra MAP chinasi) che trasloca al nucleo dove fosforila JUN e FOS che attivano la trascrizione RAS mutato la proteina rimane permanentemente in uno stato attivato, in quanto non è in grado di idrolizzare il GTP H-RAS mutazione puntiforme codone 12 o 13 = siti ad alta mutabilità = hot spots.

Effetti degli oncogèni attivati Abl tirosin chinasi (ancorata al versante citoplasmatico della membrana, nucleo, citoplasma) Traslocazione reciproca (9;22) ABL dal cromosoma 9 al 22 si fonde con BCR formando gene chimerico. Leucemia mieloide cronica 95% dei casi ha traslocazione (9;22), nel 90% dei casi di LMC si evidenzia il cromosoma 22 più corto= cromosoma Philadelphia. Proteina di fusione p210bcr/abl . Un’altra proteina di fusione (p185) traslocazione (9;22) con un punto di rottura BCR diverso. 20-25% della leucemia linfoblastica acuta e nel 2.5% di leucemia mieloide acuta Attività tirosin chinasica maggiore

Effetti degli oncogèni attivati Abl normale quando ha localizzazione nucleare induce apoptosi BCR/ABL resta sequestrata nel citoplasma quindi inibisce apoptosi.

Effetti degli oncogèni attivati ● Fattori trascrizionali Nucleo Aumento dei livelli Prodotto più duraturo o attivo myc Iperespresso (amplificazione, mutazione) Traslocazione

MYC Traslocazione t(8;14) (q24;q32) anche t(8;22) o t(2;8) nel linfoma di Burkitt [cell B] Il gene MYC dal cromosoma 8 trasloca vicino al gene che codifica la porzione costante delle catene pesanti (CH) delle Ig sul cromosoma 14 risentendo dell’effetto attivante di suoi elementi enhancer. L’espressione costitutiva di MYC altera il sistema di controllo della trascrizione basato su dimeri MAX/MYC attivanti o MAD/MAX repressivi. Amplificazione N-MYC nel neuroblastoma

Effetti degli oncogèni attivati ● Regolatori positivi del ciclo cellulare Aumento dei livelli Prodotto più duraturo o attivo ccnd ciclina D Mutazione (facilita fosforilazione di RB quindi la proliferazione) Traslocazione t(11,14) vicino a IgH ● Inibitori di apoptosi bcl-2 reticolo endoplasmatico, membrana nucleare e mitocondriale interna Traslocazione t(14;18) Linfoma follicolare a cellule B. Vicino a enhancer IgH

Riassumendo oncogèni acquisto di funzione (gain of function) ● prodotto iperespresso amplificazione traslocazione senza formazione di proteina di fusione meccanismi epigenetici ● prodotto alterato iperfunzionante mutazione puntiforme traslocazione con formazione di proteina di fusione effetto dominante.

Implicazioni terapeutiche di oncogèni Inattivare la funzione acquisita • Anticorpi • Inibitori specifici • Oligonucleotidi antisenso

Implicazioni terapeutiche di oncogèni • HER-2/neu/ErbB2 Iperespresso, amplificazione, ca mammario (circa 30%) Il signalling è inibito dal legame all’anticorpo anti HER-2 (umanizzato) HERCEPTIN • KIT Attività tirosin chinasica è inibita da STI571, piccola molecola che inibisce anche attività di BCR-ABL e di PDGF-R β Tumori stromali gastrici e leucemia mieloide cronica

Implicazioni terapeutiche di oncogèni RAS ancoraggio alla membrana catalizzato dall’enzima farnesiltransferasi Inibitori della farnesiltransferasi