Primi studi sugli effetti inibitori in colture miste: fine 800 Studi specifici sui produttori di penicillina (Fleming): anni 20-30 Applicazioni cliniche: anni 40 Scoperta e sviluppo cefalosporine: anno 50-60  

Sono antibiotici contenenti un anello eterociclico beta-lattamico, tra cui penicilline, cefalosporine, cefamicine etc (figura).

Sono prodotte principalmente da funghi dei generi Penicillium e Cephalosporium, ma anche da batteri (Streptomyces ed eubatteri).

Sono composti oligopeptidici di sintesi non ribosomale Sono composti oligopeptidici di sintesi non ribosomale. Le vie biosintetiche elucidate dal 1985: da allora industria e accademia hanno identificato e clonato i geni biosintetici e messo a punto sistemi di trasformazione dei produttori (> sostituzione dei vecchi approcci di miglioramento basati su mutagenesi e screening con quelli nuovi dell'ingegneria genetica) Organismo Antibiotico Geni Penicillium chrysogenum Penicillina (anello tiazolidinico) Pen Cephalosporium acremonium Cefalosporina (anello diidrotiazinico) Cef Streptomyces clavuligerus Cefamicina Cmc

I precursori biosintetici sono gli aa: (L) aminoadipato COOH-CH(NH2)-(CH2)3- COOH (L) cisteina COOH-CH(NH2)-CH2 – SH (L) valina COOH-CH(NH2)-CH –(CH3)2   Gli aa vengono condensati dalla ACV sintetasi e circolarizzati (anelli betalattamico e tioazolidinico) dalla isopenicillina N sintetasi. La isopenicillina N è un intermedio importante da cui partono due vie: la prima porta alla penicillina N (epimerasi; aminoadipile L  D) ed eventualmente alle cefalosporine, cefamicine (a seconda dell’organismo; vedi in seguito) la seconda porta ad acido 6 aminopenicillanico o, in presenza di fenilacetato, a penicillina G (acilasi). Possono essere usati anche altri acidi come substrati della acilasi per produrre penicilline differenti

Penicilline semisintetiche: si ottengono per modificazione chimica di una penicillina di origine microbica. In genere si seguono i seguenti passaggi:   fermentazione in presenza di fenilacetato  penicillina G isolamento della penicillina G e deacilazione a 6APA con metodi chimici o enzimatici (acilasi purificate) acilazione con cloruro acilico R-COCl

Gli antibiotici beta-lattamici interagiscono con gli enzimi biosintetici della parete batterica, in particolare con quelli coinvolti nella la biosintesi del peptidoglicano, un polimero presente in diversa quantità nei batteri gram+ e gram-, ma assente nei mammiferi e altri microrganismi. La sintesi del peptidoglicano avviene nei seguenti passaggi:   sintesi dei precursori e monomeri (N-acetilglucosamina (NAG) e N-acetilmuramico (NAM): i residui di NAM sono derivatizzati con pentameri L-ala – L-gln – L-lys – D-ala – D-ala) nel citoplasma trasporto dei precursori e monomeri dal citoplasma al periplasma polimerizzazione dei filamenti di -- (NAM-NAG)n-- costituzione della trama della parete per transpeptidazione Un pentamero di glicina con l’NH2 terminale libero può essere presente in alcuni batteri legato a L-lys: la TRANSPEPTIDAZIONE avviene o tramite l’ultima glicina o direttamente tramite l’NH2 terminale della lisina sull’ultimo legame peptidico del pentamero (legame D-ala – D-ala) di un’altra catena NAG-NAM e viene eliminata una D-ala

La penicillina è strutturalmente simile al dimero D-ala – D-ala e si lega in modo irreversibile alla transpeptidasi bloccando la sintesi della parete.   La sensibilità dei batteri ai beta-lattamici varia a seconda della specie e dell’antibiotico. I gram+ sono mediamente più sensibili, ma ci sono anche beta-lattamici specificamente attivi sui gram-.

La resistenza batterica agli antibiotici betalattamici puo’ derivare da: presenza di geni codificanti per enzimi chiamati beta-lattamasi, o specificamente penicillinasi. Questi enzimi idrolizzano l’anello beta-lattamico inattivando l’antibiotico. I geni sono spesso presenti su plasmidi e non cromosomali mutazione del bersaglio (transpeptidasi) dell'antibiotico in una forma insensibile alterazione della permeabilità al composto

Tabella 28.2.2 - Sensibilità dei batteri a differenti penicilline (in alto) e cefalosporine (in basso). La scala cromatica rosso – arancio – giallo – verde – blu rappresenta la scala di sensibilità: da molto sensibile (bassa MIC) a resistente (MIC elevata). La penicillina è particolarmente efficace solo sui Gram-positivi, mentre la temocillina è efficace solo sui Gram-negativi. Alcuni farmaci sono ad ampio spettro, come l’ampicilline e in genere le cefalosporine.

Le cefalosporine hanno la stessa attività inibitoria delle penicilline sulla biosintesi della parete. Con la tecnologia delle penicilline semisintetiche le cefalosporine sono passate in secondo piano, almeno fino all’utilizzo del 7ACA per le cefalosporine semisintetiche.   La biosintesi parte dalla penicillina N (mappa metabolica), che subisce l’espansione dell’anello tioazolidinico in diidrotioazinico e l’idrossilazione (espandasi e idrossilasi: in alcuni organismi è un enzima unico bifunzionale). L’ultimo passaggio è l’acetilazione dell’ossidrile (acetiltransferasi) per dare cefalosporina C. Le cefamicine vengono sintetizzate da carbamoilasi (-CONH2) e idrossilasi a partire da DAC. L’idrolisi dell’aminoadipile da’ acido 7 aminocefalosporanico (7ACA).

Varianti naturali e semisintetiche della cefalosporina C prevedono la sostituzione dell’aminoadipile e/o dell’acetile. L’aminoadipile non può essere sostituito per via fermentativa semplicemente aggiungendo al terreno il precursore sostitutivo in quanto i produttori (es Cephalosporium acremonium) non hanno aciltransferasi specifiche. Le penicillinasi non sono attive sulle cefalosporine.

ACV sintetasi   ACV intermedio biosintetico comune da aminoacidi attivati: ATP + aa  AMP-aa + PP (A-PO4- -COR: acile attivato) Non ancora definito l'ordine di reazione degli aminoacidi La valina cambia configurazione durante la sintesi di ACV (LD) L'aminoadipato viene da intermedi della biosintesi della lisina (funghi) o da modificazioni della lisina (batteri) ed è sintetizzato praticamente solo per l'ACV dalla Lisina amminotrasferasi (LAT) il cui prodotto è successivamente ossidato al corrispondente acido amminoadipico: (Lis)-CH2NH2  (Lis)-CH2OH  (Lis)-COOH = aminoadipato

Sintesi precursori

IPN sintetasi   Ossidasi ferro-dipendente, cofattori: Fe2+, ascorbato, O2 Meccanismo di reazione a due passaggi con ferro coordinato a zolfo e intermedio monociclico, ossigeno accettore di elettroni Possibilità di sintetizzare in vitro nuove penicilline con IPNS e substrati simili ad ACV

Acil trasferasi (AT)   E' attivo con vari substrati acil-SCoA: in associazione con la capacità del produttore - P. chrysogenum - di formare vari acil-SCoA si ha la possibilità di sintetizzare in vivo centinaia di penicilline diverse. L'enzima attivo deriva dalla maturazione (autolitica?) di un pro-peptide. La cisteina terminale dell'enzima attiva il gruppo acilico che viene poi trasferito al substrato dall'attività tioesterasica: ENZ-Cis + acil-SCoA  ENZ-Cis-acil + CoASH ENZ-Cis-acil + IPN + H2O  acil-6APA + aminoadipato + ENZ-Cis

I geni biosintetici dei beta-lattamici sono: Molto conservati evolutivamente (trasferimento genetico orizzontale tra procarioti ed eucarioti?) I geni si sono in alcuni casi duplicati e ciascuno ha subito una evoluzione funzionale, esempio: cefEF (C. acremonium) espandasi+idrossilasi  trasferimento in S. clavuligerus  duplicazione genica  cefE+cefF  evoluzione funzionale  cefE (espandasi+idrossilasi residua), cefE (idrossilasi+espandasi residua) Clusterizzati Associati a geni di resistenza

Molti geni sono stati isolati, clonati e sequenziati e sono stati sviluppati sistemi di trasformazione per i produttori (miglioramento della produzione) e per organismi modello correlati (es A. nidulans il primo ad essere trasformato, marcatore auxotrofico, genetica sviluppata) per studi di base. Primo produttore trasformato: C. acremonium (frequenza bassa, integrazione non omologa, marker dominante con promotore pcbC). Per alcuni produttori batterici (Nocardia lactamdurans) sono stati messi a punto anche sistemi di trasformazione plasmidici.   La trasformazione permette di sviluppare sistemi di miglioramento mirato della produzione: dosaggio genico distruzione genica addizione di nuovi geni (es vie biosintetiche nuove o miste)

La sintesi della penicillina è compartimentata: ACVS associata al vacuolo IPNS solubile, citoplasmatica AT associata ad organelli

Organismo: Penicillium chrysogenum   Produzione: anni 50 = 10 mg/L anni 80 = 30.000 mg/L Criteri di selezione dei mutanti (naturali, indotti per raggi X o UV): titolo di produzione caratteristiche di crescita vigorosa resistenza ai precursori R attività aciltransferasica

Fasi del processo 1 - germinazione spore da stock in beuta (2-4 giorni) in terreno contenente glucosio, corn steep liquor (CSL: ricco di zuccheri, sostanze azotate, vitamine e fattori di crescita) o farina di soia, ammonio solfato, fosfati, calcio, potassio, grassi animali e/o vegetali. Dopo la germinazione si effettua uno "scaling up" della coltura   2 - inoculo del seed-tank (5% del volume del fermentatore vero e proprio che raggiunge i 300.000 L) e incubazione per 4 giorni 3 - inoculo del fermentatore. Il terreno è sostanzialmente lo stesso: possono variare la fonte C e per la presenza dei precursori R. Il pH è regolato a 6.5-7.5 La temperatura 25°C Areazione sufficiente durante tutta la crescita (da 0.3 m3/m3 a 1 m3/m3) Durata del processo 8-10 giorni La fermentazione non è mai un puro batch: vengono aggiunti la fonte C (in modo da mantenerla limitante e favorire la fase produttiva) il CSL (per consentire lo sviluppo del micelio) il precursore R (che in genere è tossico ed è aggiunto solo alla fine del processo per la conversione del prodotto).

Fine del processo - downstream 4 - filtrazione del terreno, separazione dal micelio ed eventuale estrazione di residuo del prodotto dal micelio   5 - acidificazione (pH4) ed estrazione con solvente (es butilacetato) 6 - alcalinizzazione con acetato di potassio e precipitazione della penicillina 7 - riestrazione con soluzione acquosa di bicarbonato a pH7.8. Il processo di solubilizzazione (in acido con solvente organico) e precipitazione (con alcali, e successiva solubilizzazione in soluzione acquosa alcalina) viene ripetuto fino ad avere un prodotto sufficientemente puro 8 - deacilazione della penicillina G in colonna di penicillin acilasi immobilizzata a pH7  6APA. A pH7 6APA è neutro, e può essere precipitato per aggiunta di acido a pH4 9 - semisintesi: 6APA + RCOCl  RCO-APA + HCl

Per l'ottimizzazione del processo, le aggiunte vanno opportunamente valutate nel tempo e nella quantità. Ad es nel processo globale, il glucosio viene ripartito dalla coltura nel seguente modo: crescita = 70% mantenimento = 25% penicillina = 5%   Nell’ottimizzazione del processo vanno considerati i seguenti parametri: velocità di crescita (μ) esigenza energetica dell’organismo (g glucosio/g biomassa/h) produttività (g penicillina/g biomassa/h oppure g penicillina/g glucosio/h) resa (g penicillina/g glucosio) Altri fattori di importanza per il processo sono: tempo totale del processo volume del reattore tempo di lavorazione del prodotto dopo la fermentazione composizione e costo del terreno