Oncologia Sperimentale I - II METASTASI SPERIMENTALI RIPRODUZIONE DEL PROCESSO METASTATICO IN VIVO 5° S. Beninati

Modelli sperimentali in vivo Permettono di valutare due parametri: proliferazione Colonizzazione/invasione Ogni altro parametro non è valutabile

IL MODELLO ANIMALE SONO UTILIZZATI DIVERSI MODELLI ANIMALI PER RIPRODURRE IL PROCESSO METASTATICO E LA SUCCESSIVA INVASIONE E COLONIZZAZIONE DELL’ORGANO BERSAGLIO I MODELLI CHE SI USANO COMUNEMENTE PERMETTONO DI INOCULARE CELLULE TUMORALI DIRETTAMENTE NELL’ANIMALE IN DIVERSE PARTI DEL CORPO: INTRAMUSCOLO INTRASPLENICA INTRAPERITONEALE ENDOVENA INTRAOCULARE SOTTOCUTANEA

Parametri: Volume,Peso,Aspetto, angiogenesi, necrosi tumore Capsula connettivale Tumore primario indotto con inoculo intramuscolare di cellule di melanoma murino

MODELLI ANIMALE DI MELANOMA Due modelli animali sono utilizzati per lo studio del melanoma: Il modello polmonare Il modello splenico

Animali I topi del ceppo C57BL/6 sono utili se si usano linee cellulari di melanoma murino (B16-F10;B16-FLr6) Utilizzando topi singenici*, cioè dai quali sono state ottenute le linee tumorali, è ridotto drasticamente il fenomeno del rigetto. *individui della stessa specie che sono geneticamente identici, per esempio animali dello stesso ceppo consanguineo. Cellule proveniente da individui singenici possono essere usate per modelli di trapianto d'organo e tumorali.

C57BL/6

Modello splenico Una sospensione di cellule di melanoma viene iniettata direttamente nella milza dell’animale. Inoculo nella milza

Le cellule di melanoma passano in circolo e invadono il fegato. Le metastasi sono visibili poichè ricche di melanina nera. Fegato con metastasi

Modello Polmonare Le cellule di melanoma murino C57BL/6 sospese nel mezzo di coltura vengono iniettate endovena nella vena caudale dell’animale. Vena caudale

Attraverso il circolo raggiungono un solo organo bersaglio: il polmone Anche in questo caso le metastasi sono visibili poiché ricche di melanina. Polmoni di controllo

metastasi Polmone di topo C57BL/6 invaso da cellule tumorali di melanoma B16-F10

Valutazione del potere metastatico E’ possibile valutare il numero di metastasi superficiale per mezzo di una conta visiva. Il metodo risulta empirico e poco preciso in particolare in presenza di un alto numero di metastasi. E’ necessario considerare che l’organo bersaglio è invaso anche nel suo stroma interno. Quindi la conta superficiale è sicuramente poco significativa

Polmone di topo C57BL/6 invaso da metastasi di cellule B16-F10 Polmone di topo C57BL/6 invaso da metastasi di cellule B16-F10 trattato con antineoplastici

Modello istologico di valutazione del potere metastatico Per poter effettuare una conta delle metastasi attendibile è necessario considerare anche le metastasi interne. A tal fine l’organo bersaglio viene sezionato in sottili fettine, per mezzo di un microtomo. Il microtomo permette di ottenere fettine sottilissime e trasparenti, denominate “sezioni istologiche seriate”

Sezioni istologiche seriate di polmone di topo C57BL/6 inoculato con cellule B16-F10 18

Analisi di immagine computerizzata Ogni singola sezione viene analizzata al computer con un software adatto per la misura di cinque parametri principali: 1. area della sezione istologica 2. area delle metastasi 3. numero di metastasi 4. area occupata dalle metastasi 5. percentuale di colonizzaione

Elaborazione morfometrica Il computer elabora i parametri precedenti e il risultato permette di valutare: 1. area totale della sezione istologica (TA) 2. area media di una metastasi (AAMF) 3. area metastatica totale (TMA)

Invasione e proliferazione IL modello di calcolo nasce da due considerazioni: La cellula tumorale invade l’organo bersaglio e quindi inizia a proliferare. L’invasione può essere valutata considerando il numero di metastasi Mentre la proliferazione valutando le dimensioni delle metastasi

Elaborazione dei dati L’analizzatore di immagini permette quindi di calcolare: L’area totale della sezione istologica TA L’area metastatica totale MTA L’area media di una metastasi AAMF. Attraverso questi parametri si ricavano tre indici.

Indice di invasione Il rapporto TMA/AAMF Si definisce Indice di Invasione o “Invasion Index” (II) II=TMA/AAMF TMA= area metastatica totale AAMF= area media di una metastasi

Invasione Infatti il rapporto TMA/AAMF definisce il numero di metastasi totale, poiché deriva da: TMA= area metastatica totale AAMF= area media di una metastasi

Indice di proliferazione Il rapporto AAMF/TA Si definisce come indice di crescita o “Growth Index” (GI) GI=AAMF/TA AAMF= area media di una metastasi TA= area totale della sezione istologica

Indice di colonizzazione Il rapporto TMA/TA x 100 Esprime la percentuale di colonizzazione, indicando quanta area è stata occupata dalle metastasi. Si indica come %CI TMA= area metastatica totale TA= area totale della sezione istologica

Applicazione pratica Due molecole con potenziale attività antineoplastica sono state saggiate e hanno dato i seguenti indici: Molecola %CI (col. Index) GI(growth index) II (invasion index) Controllo 33,6 110 30,6 Teofillina (TH) 7,9 90 7,5 Controllo 33,2 110 150,0 Βeta-teofillina (HET) 5,7 120 24,0 Colonizzazione proliferazione invasione

teofillina Molecola %CI (col. Index) GI(growth index) II (invasion index) Controllo 33,6 110 30,6 Teofillina (TH) 7,9 90 7,5 -76,5% -18% -75,5% % di: colonizzazione proliferazione invasione La molecola risulta essere antimetastatica e poco antiproliferativa

Beta-teofillina Molecola %CI (col. Index) GI(growth index) II (invasion index) Controllo 33,2 110 150,0 Βeta-teofillina (HET) 5,7 120 24,0 % di: -82,8% 0% -84% colonizzazione proliferazione invasione La molecola risulta essere altamente antimetastatica e non influenza la crescita tumorale

Confronto fra molecole E’ possibile comparare gli indici di varie molecole potenzialmente antineoplastiche. In tal modo si può utilizzare un farmaco mirato per il tipo di tumore.