Funzione di ricoprimento Fenomeni cooperativi nei processi di associazione Siti di binding interagenti Il processo è funzione della frazione del numero di molecole legate, ovvero dei parametri θ e β. Quanto maggiore è il numero di molecole legate, tanto maggiore è la probabilità che queste interagiscano tra loro. Funzione di ricoprimento Langmuir

= costante di associazione del processo cooperativo

La costante di equilibrio del processo di associazione è funzione del grado di associazione . cooperatività positiva anticooperatività

cooperatività () > 0 anticooperatività () < 0 

In analogia alla equazione di Langmuir: Da cui si ottiene:

Variazione dell’energia libera al variare del numero di siti occupati Nel caso di cooperatività positiva:

Associazione fra ioni Fe(III) e poli(L-glutammato) di sodio (pH=7, T=8°C)  Cf 

βmax=0.3 n=1 ω=-0.8kcal·mol-1

Modello di Hill P = macromolecola n = siti di legame identici ma interagenti Un modello a cooperatività infinita: l’associazione della prima molecola favorisce talmente il legame delle successive, che in soluzione esistono solo le specie: P = macromolecola libera X= legante libero PXn= macromolecola con gli n siti disponibili tutti occupati In soluzione esiste quindi il solo equilibrio: P + nX ⇄ PXn

Da cui: Nella pratica si introduce il parametro (sperimentale) di Hill nH: Langmuir cooperatività infinita Sperimentalmente si osserva una cooperatività che varia tra il 30% e il 70%.

θ Langmuir Isoterma di associazione per diversi valori di nH a uguali valori di K’. Per K’Cf= 1 θ=0.5 (?)

Riarrangiando: Grafico di Hill nH ln K ln Cf

Equilibri di associazione tra Emoglobina e ossigeno (Hb)4 + nO2 ↔ (Hb)4·(O2)n

nH=2.8 (a θ=0.5) Il grado di cooperatività del processo è quindi del 70%, poiché:

nH = 1 nH = 2.8

Modello Monod-Wyman-Changeux Effetto allosterico – l’associazione di un substrato su un sito diverso da quello catalitico provoca modifiche conformazionali dell’enzima che influenzano direttamente la velocità della reazione. In presenza di più siti attivi e di una diversa affinità del substrato per i diversi siti di binding si osserva un andamento sigmoidale delle curve cinetiche tipico di processi cooperativi. Il modello MWC è stato applicato a sistemi proteici complessi con più subunità interagenti.

1. Macromolecola costituita da R sub-unità, ciascuna caratterizzata da un sito di legame. 2. Ogni sub-unità può assumere solo due stati conformazionali A e B in equilibrio tra loro. A⇄ B In assenza di legante legato: 3. Il legante X ha affinità diversa per i due stati conformazionali:

A+X ⇄AX B+X ⇄BX 4. vi sono n siti di binding sia per la conformazione A, che per la conformazione B.

In soluzione saranno presenti gli equilibri complessivi (1 i  n): A + iX ⇄AXi B + iX ⇄BXi Il numero medio di molecole di legante associate alla macromolecola sarà:

Dal modello MWC si ottiene: Dividendo numeratore e denominatore per (1+z)n-1: Ponendo:

Langmuir fattore allosterico Caso limite per [X]→0: z<<1 hz<<1

Langmuir MWC h<1

Caso limite per [X]→∞: z >> 1 y ≈ h saturazione Per L0=0 o L0=∞ (unica conformazione A o B, rispettivamente): (non cooperativo) Per h=1 (y=1): (non cooperativo) L’effetto allosterico è intrinsecamente legato al binding preferenziale del legante su una conformazione. L’associazione sposta l’equilibrio conformazionale e favorisce il binding di altre molecole di legante ( cooperatività)

Trattazione MWC (linea continua) dei dati sperimentali di associazione Fe(tetrapiridina)3+/poli(L-glutammato), pH=7.2: L0=30 n=20 KA=7.4·10-4M-1 h=0.23

Equilibri di associazione tra Emoglobina e ossigeno Trattazione MWC R=4: 2 sub-unità α + 2 sub-unità β (P.M.=66000 Daltons) n=4: 1 gruppo eme per ciascuna sub-unità n = 1 n = 4

Nel caso di un binding di tipo non cooperativo (puramente statistico):

Sperimentalmente: Nel modello MWC si introduce un equilibrio conformazionale tra due conformazioni T (tense) e R (relaxed): R ↔ T

Eme pentacoordinato ponte salino Eme esacoordinato

KT<<KR

T=23°C: KR=4·10-2 mmHg-1 L°=12550 h=0.014