Glick B. R. e Pasternak J.J. : “Biotecnologia Molecolare”. Ed. Zanichelli Watson: “Dna ricombinante”. G. Poli: “Biotecnologie” Principi ed Applicazioni dell’Ingegneria Genetica. Ed. UTET L. Alberghina e E. Cernia: “Biotecnologia e Bioindustria”. Ed. UTET.

Le BIOTECNOLOGIE + “Biologia” “Tecnologia” Biotecnologie tradizionali Biotecnologie innovative

TRATTAMENTO A MONTE FERMENTAZIONE E BIOTRASFORMAZIONE MATERIA PRIMA TRATTAMENTO A MONTE FERMENTAZIONE E BIOTRASFORMAZIONE TRATTAMENTO A VALLE PRODOTTO PURO

Biologia Microbiologia Genetica Biochimica Biologia Ingegneria molecolare cellulare genetica BIOTECNOLOGIA MOLECOLARE RACCOLTI ALLEVAMENTO FARMACI VACCINI DIAGNOSTICI

Campi di applicazione delle biotecnologie Green Biotechnology White Biotechnology Red Biotechnology

E. coli gram negativo Non patogeno Corto (<1mm) Nell’intestino dell’uomo Si moltiplica per scissione binaria in un medium ricco di ioni. In un medium ricco di aa, vitamine, sali, elementi in tracce cresce a 37°C in 20’ ORGANISMI DIVERSI Forniscono geni per funzioni specifiche come quelli che codificano DNA-polimerasi termoresistenti Vengono manipolati geneticamente per migliorare la resa di aa di importanza industriale (Corynebacterium glutamicum) ALTRI BATTERI Bacillus brevis Bacillus subtilis Erwinia erbicola Pseudomonas Rizobium Streptomices Xantomonas campestris

Saccharomyces cerevisiae Lievito unicellulare non patogeno (5 mm di diametrro). Si riproduce per gemmazione e prolifera in un medium semplice. Zuccheri Etanolo + CO2 1996 completata la sequenza del suo genoma. Compie modificazioni post-traduzionali. Saccharomyces pombe Pichia pastoris Saccharomyces diastaticus Hansenula polymorpha Yarrowia Lipolytica

CELLULE EUCARIOTICHE IN COLTURA TESSUTI enzimi proteolitici CELLULE in un medium ricco di aa, vitamine, sali, glucosio, antibiotici, fattori di crescita divisioni cellulari MONOLAYER Le colture primarie si mantengono per 50-100 generazioni LINEE CELLULARI STABILIZZATE Per esprimere Produzione a livello industriale di vaccini la proteina determinata da una sequenza di cDNA clonata Mantenere in vita i virus

TERRENI DI COLTURA NATURALI SINTETICI SPECIALI SELETTIVI COLTURE SOLIDE COLTURE LIQUIDE COLTURE PURE: costituite da microrganismi originati da un solo individuo e quindi tutti uguali (diluizioni seriali e piastratura). CARATTERISTICHE DEI CEPPI UTILIZZATI Non andare incontro a mutazioni Avere buone capacità riproduttive Fermentare in breve tempo Produrre il prodotto desiderato Essere conservato (liofilizzazione, congelamento) Essere migliorato geneticamente Conservazione dei ceppi

Incubazione a 28°C in anaerobiosi COLTURE PURE Incubazione a 28°C in anaerobiosi x 7/10 giorni semina di diluizioni seriali Conta delle COLONIE (CFU/ml) OSSERVAZIONE MORFOLOGICA DELLE COLONIE Isolamento di ceppi di batteri

ELEMENTI COSTITUENTI DEI TERRENI Acqua Carbonio (Pseudomonas, batteri che ossidano il metano) Azoto e Zolfo (Sali d’ammonio, nitrati, Urea) Fosforo Elementi minerali:(sodio, potassio, magnesio, calcio, ferro, manganese, rame, cobalto, zinco e molibdeno) Fattori di crescita: (vitamine, amminoacidi, a.grassi) Ossigeno: AEROBI OBBLIGATI ANAEROBI OBBLIGATI FORME INTERMEDIE Scarsa solubilità (recipienti sotto pressione) Aria

Log numero delle cellule Fase DI MORTALITA’ Fase STAZIONARIA Log numero delle cellule Fase ESPONENZIALE Tempo Fase DI LATENZA Processi fed-batch (o alimentazione discontinua) Processi continui

PREPARAZIONE DEL TERRENO DI COLTURA TERRENO DI COLTURA STERILE COLTURA CELLULE ENZIMI MATERIE PRIME PRETRATTAMENTO PREPARAZIONE DEL TERRENO DI COLTURA Sostanze Nutritive Acido/Base CELLULE ENZIMI IN CRESCITA LIBERI IMMOBILIZZAZIONE STERILIZZAZIONE CATALIZZATORE BIOLOGICO TERRENO DI COLTURA STERILE CONVERSIONE

TERRENO DI COLTURA STERILE CATALIZZATORE BIOLOGICO TERRENO DI COLTURA STERILE ULTERIORI SOSTANZE NUTRITIVE ACIDO/BASE OSSIGENO CONVERSIONE CATALIZZATORE BIOLOGICO SEPARAZIONE DEL CATALIZZATORE TERRENO DI COLTURA ESAURITO RECUPERO RIFIUTI RIFIUTI PURIFICAZIONE PRODOTTO

Prodotto esocellulare Fermentatore Brodo di fermentazione Centrifuga Brodo chiarificato Ultrafiltrazione Brodo chiarificato e concentrato Precipitazione con Sali (NH4)2SO4 Soluzione con precipitato proteico Centrifuga Solido precipitato Solubilizzazione del precipitato Soluzione Ultrafiltrazione (dialisi) Soluzione dializzata Cromatografia Prodotto esocellulare

Dialisi La dialisi consiste nel porre la soluzione proteica, o il precipitato, in un sacchetto costituito da una membrana semipermeabile che si immerge in acqua o in una soluzione salina Sacchetto in rotazione Cambio del mezzo dializzabile Tampone Soluzione concentrata Sacchetto da dialisi

SECREZIONE - Evita la digestione - Facilita la purificazione E.coli normalmente non secerne proteine perché ha la membrana esterna Soluzioni Usare cellule di batteri gram+ o cellule eucariotiche Ingegnerizzare batteri gram- sequenze segnale: proteina legante + Interleuchina 2 il maltosio

Proteina legante il maltosio (MBP) Sequenza linker Proteina legante il maltosio (MBP) Ile-Glu-Gly-Arg Interleuchina 2 Sito di idrolisi del Fattore Xa diminuizione del livello di espressione della proteina batteriocina (meccanismo a cascata) Funghi Aspergillus promotore della glucoamilasi + sequenza segnale + Interferone + Amido >quantità di Interferone 1mg / 1litro di coltura

Prodotto endocellulare Fermentatore Recupero cellule Lisi cellulare Chiarificazione del lisato Separazione del corpuscolato Sovranatante Ultrafiltrazione (concentrazione) Precipitazione con Sali (NH4)2SO4 Separazione del precipitato Solido precipitato Solubilizzazione del precipitato Ultrafiltrazione Prodotto endocellulare Cromatografia

Metodo di lisi Non meccanico Meccanico Fisico Sonicatori ad ultrasuoni Trattamento al calore Congelamento e scongelamento Shock osmotico Chimico Solventi organici (toluene-lievito) Detergenti (denaturanti [SDS] e non) Enzimatico Lisozima Mannasi, Pectinasi, Cellulasi Sonicatori ad ultrasuoni mulini con sfere abrasive presse o estrusori Omogeneizzatori - Bisogna fare attenzione alla produzione di calore (azione denaturante) tampone

PROCEDURE DI FRAZIONAMENTO tecniche preliminari di purificazione Denaturazione indotta dal calore o dal pH Precipitazione isoelettrica Frazionamento con Sali Frazionamento con solventi organici effetto denaturante (abbassano la costante dielettrica del mezzo) Frazionamento con polimeri organici (PEG) effetto non denaturante Precipitazione mediante ioni di metalli pesanti (Hg aggiunto al siero si pone a ponte tra due molecole di albumina, legando gruppi SH, il dimero precipita più facilmente)

Procedure di frazionamento Frazionamento per denaturazione indotta dal calore o dal pH Vengono sfruttate le differenze nella sensibilità al calore e agli estremi di pH delle varie proteine Frazionamento con sali L’aggiunta di sali inorganici può determinare un’alterazione delle interazioni molecolari Salting in (il sale, a basse concentrazioni, aumenta la solubilità) Salting out (il sale, ad alte concentrazioni, diminuisce la solubilità) I sali più comunemente usati sono il solfato di ammonio, il solfato di sodio ed i fosfati di potassio Le prime proteine che formano aggregati sono quelle con un maggior numero di residui idrofobici sulla superficie

Dosaggio attività nel SV2 ESTRATTO GREZZO + 100 mM (NH4)2SO4 disponibile in grande quantità buon grado di purezza alta solubilità (4 M) stabilizzante, previene gli inquinamenti batterici PRECIPITAZIONE CENTRIFUGAZIONE PELLET SOVRANATANTE + 200 mM (NH4)2SO4 Dosaggio attività PRECIPITAZIONE e CENTRIFUGAZIONE Dosaggio attività nel SV2 Si deve trovare una concentrazione di sale in cui nel sovranatante l’attività della proteina in esame sia assente

Frazionamento con solventi organici Si basa sulle differenze nella solubilità delle diverse proteine in soluzioni acquose di vari solventi organici, quali etanolo, acetone e butanolo Il solvente organico abbassa la costante dielettrica del mezzo, aumentando le interazioni elettrostatiche tra le proteine (a discapito delle interazioni proteina-acqua) e determinandone la precipitazione (ha effetto denaturante) Frazionamento con polimeri organici Risulta simile, nel principio, al frazionamento con solventi organici (non ha effetto denaturante) Il polimero più comunemente usato è il PEG

Precipitazione mediante ioni di metalli pesanti Certi ioni metallici (Zn2+, Hg2+, Fe3+, Cu2+, Pb2+) presentano un’elevata specificità per alcuni gruppi reattivi presenti nelle molecole proteiche Legandosi ad essi, determinano la precipitazione di alcune proteine Questa procedura può essere utilizzata per allontanare le proteine contaminanti da una soluzione proteica Precipitazione isoelettrica Si basa sul fatto che le proteine presentano la solubilità più bassa al loro punto isoelettrico (sono minimi gli effetti repulsivi intermolecolari) Variando opportunamente il pH si fa precipitare la proteina di interesse lasciando le altre in soluzione e viceversa