Principali classi di mutazioni 1

Regole per valutare la patogenicità di una mutazione I - Delezioni dell’intero gene, mutazioni non senso e anomalie della cornice di lettura molto probabilmente distruggono la funzione del gene e sono quindi patogenetiche. - Mutazioni che cambiano i siti di splicing GT……AG che fiancheggiano gli introni molto probabilmente avranno un effetto sullo splicing e quindi solitamente portano ad un’abolizione della funzione del gene e quindi alla malattia. Gli effetti dei cambiamenti nucleotidici a carico delle altre regioni introniche sono difficili da predire e dovrebbero essere verificati con tecnologie alternative (ad es RT-PCR).

Regole per valutare la patogenicità di una mutazione. II Una mutazione missenso ha più probabilità di causare una malattia se si trova in una porzione del gene che è funzionalmente importante (Ex DNA binding domain PAX3). - Se cambia un amminoacido che è molto conservato tra specie diverse (ortologhi) o tra membri della stessa famiglia di geni (paraloghi) ci sono più probabilità che la mutazione sia patogenetica.

Regole per valutare la patogenicità di una mutazione. III - Le sostituzioni aminoacidiche hanno più probabilità di annullare la funzione di un gene se sono non conservative (sostituzione di una aa polare con uno non polare o viceversa, o di uno acido con uno basico e viceversa). - Un cambio nella sequenza di un gene che è presente per la prima volta in un paziente affetto in una determinata famiglia (de novo) e non è presente nei genitori non malati ha alte probabilità di essere patogenetico.

Gli effetti di un allele mutante Come capire se un cambio nella sequenza del DNA e’ patogenico se il cambio e’ stato’ gia osservato in pazienti affetti dalla stessa malattia - una mutazione de novo assente nei genitori di una persona con una malattia de novo - un nuovo cambio assente in un numero di almeno 100 cromosomi sani - il tipo di cambio studi funzionali 5

Validazione di un gene candidato ad essere responsabile di una malattia genetica Analisi di Mutazioni Analisi funzionale di una mutazione Generazione di un modello animale per una malattia genetica

Biotecnologie per la diagnosi genetica molecolare Malattie cromosomiche: cariotipo, Fluorescent in situ hybridization (FISH), Comparative Genomic Hybridization (CGH)‏ Altre Malattie geniche: – RFLP (restriction fragment length polymorphisms)‏ – Southern blotting - DNA – Northern blotting - RNA – SSCP (single-strand chain polymorphism) - DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) – DHPLC (Denaturing High. Performance Liquid Chromatography) – DNA Sequencing - MICROARRAY (CHIP)

Biotecnologie per la diagnosi genetica molecolare Malattie cromosomiche: cariotipo, Fluorescent in situ hybridization (FISH), Comparative Genomic Hybridization (CGH)‏ Altre Malattie geniche: – RFLP (restriction fragment length polymorphisms)‏ – Southern blotting - DNA – Northern blotting - RNA – SSCP (single-strand chain polymorphism) - DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) – DHPLC (Denaturing High. Performance Liquid Chromatography) – DNA Sequencing - MICROARRAY (CHIP)

Tecniche base di genetica molecolare Gel elettroforesi Enzimi di restrizione e taglio specifico del DNA polymerase chain reaction (PCR)

Come facciamo a vedere il DNA?

Elettroforesi su gel: visualizzazione diretta delle molecole separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA

Elettroforesi su gel : Separa le molecole per dimensione separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA separation verticale --> Acrilamide = DNA, proteine ed RNA Le molecole più piccole migrano nel gel più velocemente.

Il DNA colorato con bromuro di etidio emette una fluorescenza di colore rosso-arancio se sottoposto a luce UV.

Endonucleasi di restrizione Enzimi che tagliano il DNA a doppia elica in siti specifici

AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA “REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)”

L’invenzione della PCR Ideata da Kary Mullis nel 1983 La prima pubblicazione è apparsa nel 1985 Premio Nobel per la chimica nel 1995

Polymerase Chain Reaction - PCR La PCR rappresenta la seconda rivoluzione nelle tecniche di manipolazione del DNA. E’ essenzialmente una tecnica di amplificazione del DNA. Molte molecole DNA (singola molecola)‏ PCR amplificazione

Polymerase Chain Reaction Metodo per l’amplificazione esponenziale di sequenze di DNA Ingredienti di base Stampo di DNA o RNA 2 primers complementari a differenti regioni dello stampo DNA polimerasi termostabile 4 nucleotidi il buffer appropriato

Thermal cycler, AppliedBiosystems

Thermal Cyclers, MJ Research

Thermal Cyclers, MJ Research

TIPICA MISCELA DI REAZIONE 25 o 50l in una provetta micro Eppendorf (0.2 o 0.5 ml) COMPONENTE VOLUME Concentrazione finale 10 X PCR Buffer 5l 1X 10 X dNTPs (2mM)‏ 200M Forward primer (5 pmols/l)‏ 0.5M Reverse primer (5 pmols/l)‏ 0.5M (25pmols/50l)‏ DNA genomico stampo 2l 1g polimerasi termostabile (5U/l)‏ 0.2l 1 unità H2O (a 50l di volume finale)‏ 27.8l  

Synthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C * * A C G -T 5’ 3’ T A C G T A Uno specifico DNA a singola elica (primer o innesco) ibrida con l’elica che deve essere copiata

I cicli della PCR 30–35 cicli ciascuno comprendente: denaturazione (95°C), 10-40 sec annealing (50– 65°C), 30-120 sec polimerizzazione (68-72°C), il tempo dipende dalla lunghezza del frammento

Quanto puo’ essere grande il prodotto da amplificare? I prodotti di amplificazione sono di solito grandi 100-1500 bp. E’ possibile amplificare prodotti piu’ grandi — >25 kb. Questo richiede particolari accorgimenti tecnici (buffers, tipi di polimerasi, tempi di estensioni piu’ lunghi).

Quanto è potente la PCR? La PCR può amplificare fino ad ottenere una quantità utilizzabile di DNA (visibile su gel) in meno di 2 ore. Lo stampo di DNA non necessita di particolari purificazione se il frammento da amplificare è di dimensioni ridotte (fino a 1000bp). Il prodotto della PCR può essere digerito con enzimi di restrizione, sequenziato o clonato. La PCR può amplificare una singola molecola di DNA (es. uno spermatozoo).

Come disegnare i primers per la PCR Devono essere lunghi ~20 basi. Il contenuto G/C dovrebbe essere 45–55%. La temperatura di annealing dei due primers dovrebbe essere paragonabile. Il 3´(parte finale dell’oligo) -dovrebbe essere G o C. I primers non devono annilare tra di loro. I primers non devono contenere regioni ripetute.

Ottimizzazione della reazione di PCR Temperatura di Annealing dei primers. Concentrazione di Mg2+ nella reazione. Tempo di estensione. Concentrazione del templato

Falsi positivi in PCR Possibili fonti di contaminazione Quando e’ stato collezionato il campione Durante il trasporto In laboratorio da altri campioni di pazienti o da personale di laboratorio Sarebbe auspicabile un controllo interno Primers non sono abbastanza specifici Migliorare le condizioni di amplificazione Cambiare primers

Multiplex PCR Le reazioni di PCR possono essere ingegnerizzate in modo da amplificare simultaneamente frammenti di diversa lunghezza - spesso utilizzato in diagnostica.

Biotecnologie per la diagnosi genetica molecolare – RFLP (restriction fragment length polymorphisms)‏ – Southern blotting - DNA – Northern blotting - RNA – SSCP (single-strand conformation polymorphism) – DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) – DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography) – DNA Sequencing - MICROARRAY (CHIP)

Endonucleasi di restrizione EcoRI non taglierà questa sequenza

Mutazioni puntiformi Variazioni nucleotidiche (Mutazioni puntiformi) possono cambiare la sequenza nucleotidica e cambiare quindi il sito di restrizione. EcoRI non è in grado di tagliare le due sequenze mutate.

Southern Blotting (DNA)‏

Polimorfismi RFLP e Southern Blot Si possono identificare solamente i frammenti di DNA che ibridizzano con la sonda molecolare (probe)

Diagnosi molecolare dell’anemia falciforme La sonda non ibridizza con il frammento MstII di 0.2 Kb

Diagnosi della sindrome da androgeno resistenza per mezzo dell’analisi del Southern blot Il DNA dal gel di agarosio è stato trasferito su nitrocellulosa ed ibridizzato alla sonda cDNA di un recettore androgenetico. Si osservano 3 frammenti genomici nel DNA di entrambi i genitori ma non in quello del figlio. Conclusione: Il gene per il recettore androgenetico (AR) è X-linked. La madre ha solo un gene AR intatto (l’intensità delle bande è simile a quella della padre). Il figlio ha ereditato dalla madre il cromosoma X che ha una delezione nel gene AR.

Il “Northern blot” è una tecnica usata per determinare in quale tessuto o tipo cellulare è espresso un gene, ed anche la lunghezza e la quantità di mRNA. I livelli di mRNA sono spesso correlati ai livelli di proteina presente nel tessuto.

Biotecnologie per la diagnosi genetica molecolare – RFLP (restriction fragment length polymorphisms)‏ – Southern blotting - DNA – Northern blotting - RNA – SSCP (single-strand conformation polymorphism) – DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) – DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography) – DNA Sequencing - MICROARRAY (CHIP)

Applicazioni della PCR Diagnostica (per la ricerca di mutazioni)‏ Ricerca Genetica forense

Applicazioni della PCR: diagnostica separare e discriminare frammenti di DNA aventi uguale lunghezza ma che differiscono per la sequenza o per la composizione delle coppie di basi SSCP (single strand conformation polymorphism): (1) polymerase chain reaction (PCR) amplification of DNA sequence of interest (2) denaturation of double-stranded PCR products (3) cooling of the denatured DNA (single-stranded) to maximize self-annealing; (4) detection of mobility difference of the single-stranded DNAs by electrophoresis under non-denaturing conditions DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis): (1) polymerase chain reaction (PCR) amplification of DNA sequence of interest (2) separate DNA fragments based on their melting characteristics on a electrophoresis gel that contains a denaturing agent (urea for example) DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography): (1) polymerase chain reaction (PCR) amplification of DNA sequence of interest (2) denaturation - renaturation to create hetero-and homoduplexes from the two populations in the PCR (generation of mismatches in the heteroduplexes) (3) This mismatch will therefore decrease the interaction with the column and hence a reduced retention time compared to the homoduplexes in chromatographic separation

Biotecnologie per la diagnosi genetica molecolare – RFLP (restriction fragment length polymorphisms)‏ – Southern blotting - DNA – Northern blotting - RNA – SSCP (single-strand cconformation polymorphism) – DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) – DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography) – DNA Sequencing – MICROARRAY (CHIP)

Automated DNA sequencing I frammenti tra loro differiscono per una sola base e separati in base alla loro lunghezza tramite elettroforesi capillare con sequenziatore automatico (rilevatore sistema ottico) Sequenziamento di ultima generazione (NGS)

Possibile uso dell’NGS nella diagnostica delle malattie genetiche Targeted resequencing: sequenziamento ristretto (es. un gene molto grande o un gruppo di geni): quando si ha un forte sospetto sull’identita’ del gene responsabile Whole Exome sequencing: sequenziamento di tutte le regioni codificanti di tutti i geni del genoma: quando non si hanno sospetti sul gene responsabile o per abbattere i costi del targeted resequencing Whole Genome sequencing: tutto il genoma, ancora molto costoso, piu’ “semplice” metodologicamente

DNA CHIPS Il termine di “chips” di DNA riferisce a campioni miniaturizzati di frammenti di acidi nucleici che sono fissati su supporti di vetro non più grandi di un vetrino da microscopio.

L’innovazione tecnologica: il Gene-chip Frammenti di PCR contenenti gli esoni DMD sono spottati in triplicato su ogni array (alto- sinistra: esoni 1-24, alto destra esoni 25-48, basso-sinistra esoni 49-72, basso-destra esoni 73-79. Parte superiore = controllo sano. Parte inferiore = paziente DMD con delezione esoni 3-20

Analisi di mutazione Qualsiasi sia il test di screening utilizzato SSCP (Single Strand Chain Polymorphism), DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography) o altri il segmento anomalo dovra’ essere analizzato mediate sequenziamento diretto che confermerà il cambiamento nucleotidico e ne determinerà l’esatta natura. Quest’analisi può rivelare mutazioni deleterie (codoni di stop), indicando il ruolo patogenetico della mutazione oppure può rivelare mutazioni missenso. Per escludere la possibilità che il cambiamento nucleotidico identificato corrisponda ad un polimorfismo è necessario verificare che la variazione segreghi con la malattia nelle famiglie (in caso di mutazione ereditata) e che non sia presente in una popolazione normale di controllo. La presenza di mutazioni de novo in pazienti è un’indicazione piuttosto forte del ruolo causativo nella malattia. In caso di mutazioni missenso è anche utile valutare se il cambio nucleotidico potrebbe essere responsabile di cambiamenti drammatici nella struttura della proteina (cambiamenti amminoacidici non conservativi) o anche se gli aminoacidi soggetti a mutazioni sono molto conservati durante l’evoluzione.