METABOLISMO DEGLI AMMINOACIDI

Metabolismo degli amminoacidi: Degradazione delle proteine Incorporazione dell’azoto nell’urea Sintesi dei singoli amminoacidi

Le cellule sintetizzano continuamente le proteine partendo dagli amminoacidi e le degradano ottenendo amminoacidi 3 funzioni: Conservare il materiale nutriente nella forma di proteine Eliminare le proteine anomale Permettere la regolazione del metabolismo cellulare

DIGESTIONE DELLE PROTEINE PROTEASI GASTRICHE - pepsina (endopeptidasi) PROTEASI PANCREATICHE tripsina (endopeptidasi) chimotripsina (endopeptidasi) elastasi (endopeptidasi) carbossipeptidasi A e B (esopeptidasi) PEPTIDASI INTESTINALI ATPasi H+,K+ pH 1 pH 7.4 gradiente di pH

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Alcune proteine non possono essere correttamente digerite da individui che presentano alcune patologie. MORBO CELIACO MORBO DI HARTNUP

Degradazione intracellulare delle proteine Degradazione lisosomiale Ubiquitina Proteasoma

A. Degradazione lisosomiale i lisosomi mantengono un pH interno di circa 5.0 gli enzimi che contengono sono attivi ad un pH acido Processi normali e patologici associati ad un’aumentata attività lisosomiale regressione dell’utero dopo il parto atrofia muscolare causata dal disuso o da ferite traumatiche artrite reumatoide

Struttura ai raggi X dell’ubiquitina B. Ubiquitina Struttura ai raggi X dell’ubiquitina

IL TURNOVER DELLE PROTEINE E’ STRETTAMENTE REGOLATO Come fa una cellula a identificare le proteine che devono essere degradate? L’ UBIQUITINA, una piccola proteina di peso molecolare 8,5 Kd, presente in tutte le cellule eucariotiche, è il segnale che identifica le proteine destinate alla distruzione L’ UBIQUITINA è l’equivalente cellulare della “MACCHIA NERA “ nel libro “ L’ ISOLA DEL TESORO di Robert Louis Stevenson: è un segnale di “ CONDANNA A MORTE “. Il legame dell’ubiquitina alla proteina bersaglio è attuato da un enzima chiamato E3

Alcune condizioni patologiche illustrano molto chiaramente l’importanza della regolazione del ricambio delle proteine: 1. Il virus del papilloma umano (HPV) produce una proteina che attiva uno specifico enzima E3. 2. L’ enzima lega l’ ubiquitina alla proteina oncosoppressore p53 e ad altre proteine che controllano i meccanismi di riparazione del DNA, che sono di conseguenza distrutte 3. L’attivazione di questo enzima E3 si osserva nel 90% dei carcinomi della cervice

Se l’ubiquitina è il segnale di morte chi esegue la sentenza ? L’esecutore è un grande complesso detto proteasoma o proteasoma 26 S che digerisce la proteine combinate con l’ubiquitina Questo complesso proteolitico ATP-dipendente, composto da numerose subunità, non degrada l’ubiquitina (che viene reciclata) mentre i prodoti peptidici sono ulteriormente degradati

PROTEASOMA Il proteasoma 26 S è costituito da due componenti: Il complesso 20 S costituito da due copie di 14 subunità con una massa di 700 Kd, che contiene l’ attività catalitica. Il complesso 19 S o complesso regolatore

Questa classe di ATPasi, che si trovano in tutti gli esseri viventi, è associata ad un gran numero di funzioni cellulari, comprese la regolazione del ciclo cellulare e la biogenesi degli organelli Il processo di ubiquitinizzazione e il proteasoma collaborano nella degradazione delle proteine non più necessarie

Qual è il destino degli amminoacidi liberi ?

La prima tappa della degradazione degli amminoacidi è la rimozione del residuo azotato

Deamminazione degli amminoacidi

Rappresentazione schematica del catabolismo degli amminoacidi

Transamminazione

-OOC-CH2-CH2-C-COO- II O R-C-COO- R-CH-COO- I NH3 + -OOC-CH2-CH2-CH-COO- amminoacido a-chetoglutarato a-chetoacido glutammato

Tutti gli amminoacidi, ad eccezione di prolina, lisina e treonina, subiscono la transaminazione. a-chetoacidi: a-chetoglutarato, piruvato e ossalacetato

Le transaminasi utilizzano il PLP come cofattore che viene convertito in piridossamina

TRANSALDIMMINAZIONE In tutti gli enzimi dipendenti dal PLP il cofattore è legato, in assenza di substrato, al gruppo e-amminico di una lisina al sito attivo tramite una base di Schiff. Il riarrangiamento che porta alla formazione della base di Schiff con il substrato entrante è una reazione di transaldimminazione

LA REAZIONE DELLE TRANSAMINASI SEGUE UN MECCANISMO A PING-PONG il gruppo a-amminico dell’amminoacido va a sostituirsi al gruppo e-amminico dell’enzima. La base di Schiff che si forma tra l’amminoacido e il PLP resta fortemente legata all’enzima tramite interazioni multiple non covalenti. la stessa base perde un protone dall’atomo di carbonio a dell’amminoacido e successivamente viene idrolizzata in a-chetoacido e PLP legato solo all’NH3. un a-chetoacido (secondo substrato) reagisce con il complesso E-PLP-NH3, formando un’altra base di Schiff si produce un amminoacido (secondo prodotto) e si rigenera il complesso E-PLP PLP-E aa-NH3 PLP-NH3-aa E * PLP-NH3 + chetoacido PLP-NH3 2°chetoacido aa-NH3 + PLP- …

generica reazione di transamminazione b) transamminazione glutammato-ossalacetato (GOT) Meccanismo cinetico a ping-pong

Transamminasi in medicina

TRANSAMINASI Aspartato amminotransferasi ( AST o GOT ) -chetoglutarato + aspartato glutammato + ossalacetato Alanina amminotransferasi ( ALT o GPT ) -chetoglutarato + alanina glutammato + piruvato

AST o GOT: alta concentrazione nel miocardio, nel fegato e nel cervello aumenta nel siero in seguito a necrosi cellulare (infarto del miocardio)dopo 8-12h (liv. max dopo 24-48h; val. norm. dopo 4-7 giorni) La determinazione serve a 4 scopi: distinguere l’infarto del miocardio da una crisi di angina pectoris diagnosticare un infarto nei casi di elettrocardiogramma dubbo stabilire l’estensione dell’infarto del miocardio seguire il decorso della malattia aumento elevato di AST (100 volte sup. ai valori normali): epatite acuta avvelenamenti ALT o GPT: localizzata nel fegato, rene, miocardio, muscoli scheletrici, pancreas, milza nell’epatite virale il suo aumento è sovrapponibile a quello della AST

-OOC-CH2-CH2-C-COO- II O R-C-COO- R-CH-COO- I NH3 + -OOC-CH2-CH2-CH-COO- amminoacido a-chetoglutarato a-chetoacido glutammato Con la reazione di transaminazione il gruppo amminico è stato solo trasferito. Il suo definitivo distacco avviene con la reazione di deamminazione.

Questa reazione avviene all’interno dei mitocondri -OOC-CH2-CH2-C-COO- II O a-chetoglutarato -OOC-CH2-CH2-CH-COO- I NH3 + glutammato a- imminoglutarato NH2 NAD(P)+ NAD(P)H + H+ H2O NH4+ Deamminazione ossidativa catalizzata dall’enzima glutammato deidrogenasi Questa reazione avviene all’interno dei mitocondri Quasi tutta l’ammoniaca che si forma nell’organismo viene prodotta in questa reazione L’enzima è regolato allostericamente: + ADP GDP - ATP GTP (che entra nel ciclo di Krebs)

3 forme dello stesso scheletro carbonioso reazione importante: 1. per la sintesi dell’urea 2.per l’a-chetoglutarato libero che si forma. La glutamina rappresenta un sistema tampone che contrasta l’innalzamento della concentrazione di ammoniaca libera reazione molto importante nel rene per il controllo del pH: l’ammoniaca diffonde attaverso le cellule del tubulo distale renale e nel lume intrappola gli ioni H+ fomando ione NH4 che è escreto con le urine.

L’accoppiamento della transaminazione con la deaminazione del glutammato costituisce il processo della transdeaminazione TRANSDEAMINAZIONE

DECARBOSSILAZIONE Terza via del catabolismo degli amminoacidi che porta alla formazione delle corrispondenti ammine Le decarbossilasi sono enzimi piridossalfosfato-dipendenti

AMMINE BIOGENE CO2 istidina istamina CO2 5-idrossitriptofano vasodilatatore, stimolante dell’ attività gastrica istidina istamina CO2 Potente vasocostrittore, neurotrasmetitore 5-idrossitriptofano serotonina CO2 tirosina tiramina Agente ipertensivo CO2 3,4-diidrossifenilalanina dopamina Intermedio della sintesi dell’adrenalina

Acido --amminobutirrico GABA Acido glutammico CO2 Acido --amminobutirrico GABA Composto che svolge importanti funzioni a livello cerebrale aspartato CO2 -alanina Costituente del CoA La decarbossilazione della lisina e della ornitina porta alla formazione delle diammine cadaverina e putrescina

Decarbossilazione (piridossalfosfato dipendente) dell’acido glutammico:

I TESSUTI PERIFERICI TRASPORTANO AZOTO AL FEGATO

Esistono tre processi di incorporazione dell’NH3: Sintesi del glutammato Sintesi della glutammina Sintesi del carbamilfosfato

1. Sintesi del glutammato (amminazione riduttiva dell’a-chetoglutarato) glutammato deidrogenasi Questa reazione è un importante PUNTO DI INCONTRO tra il METABOLISMO DELL’AZOTO E IL METABOLISMO ENERGETICO, essendo l’ a-chetoglutarato un intermedio del ciclo dell’acido citrico.

2. Sintesi della glutammina Il più importante donatore di N nella biosintesi di purine, pirimidine e amminoacidi glutammina sintetasi (glutammato) (glutammina) (intermedio fosforilato)

3. Sintesi del carbamilfosfato ione bicarbonato attivato

Destino metabolico dell’ammoniaca

Il ciclo dell’urea 2 reazioni nel MT + 3 reazioni nel citosol delle cellule epatiche

Sintesi del carbamilfosfato

Sintesi del carbamilfosfato 2 ATP + HCO3- + NH3+ H2N – C –OPO3 -- + 2 ADP + Pi O Carbamil fosfato sintetasi I (CPS I) enzima mitocondriale utilizza ammoniaca come donatote di azoto richiede N-acetil glutammato CPS II -sintesi pirimidine -enzima citosolico -utilizza glutammina -non necessita di N-acetil glutammato

N-acetil-glutammato è l’attivatore allosterico della carbamil-fosfato sintetasi mitocondriale che utilizza come fonte di azoto l’NH+4. L’ N-acetil-glutammato si forma dall’ acetil-CoA+ glutammato reazione sulla quale l’ ARGININA esercita un controllo positivo

Il carbamilfosfato reagisce con l’ornitina per formare citrullina. La reazione è catalizzata dalla ornitina carbamil trasferasi (OCT)

argininosuccinato deidrogenasi In questa reazione viene introdotto il secondo atomo di azoto che si ritroverà nella molecola di urea

Meccanismo d’azione della arginosuccinato sintetasi

argininosuccinato liasi ciclo di Krebs

arginasi

Quantità di urea eliminata con le urine: 10-25g/die Concentrazione di urea nel sangue: 5-14mg/100ml Concentrazione di ammoniaca nel sangue: 0.1mg/100ml Encefalopatia da ammoniaca: un’alta concentrazione di ammoniaca stimola la sintesi di glutammato dall’a-chetoglutarato: la concentrazione di quest’ultimo nelle cellule del sistema nervoso centrale può venir meno con conseguente inibizione del ciclo di Krebs e della produzione di ATP. Disturbi del comportamento in soggetti con ammoniemia elevata: il glutammato (neurotrasmettitore inibitorio) o il GABA (suo derivato) agiscono sul SNC.

DA RICORDARE NH4+ ANIMALI AMMONIOTELICI Acido urico ANIMALI UREOTELICI molti vertebrati terrestri compreso l’uomo Acido urico ANIMALI URICOTELICI uccelli e rettili NH4+ ANIMALI AMMONIOTELICI ione ammonio la maggior parte dei vertebrati acquatici

LEGGE DELL’ ARGINASI “ L’ENZIMA ARGINASI E’ PRESENTE NEL FEGATO DEGLI ORGANISMI A RICAMBIO UREOTELICO, IVI COMPRESO L’UOMO, E’ SCARSAMENTE PRESENTE O ASSENTE NEL FEGATO DEGLI ORGANISMI A RICAMBIO URICOTELICO (uccelli e rettili)”. Prof. Clementi (1913) Nel 1932: Premio Nobel a Krebs per il ciclo dell’urea Nel 1998: Premio Nobel al prof Ignarro per la sintesi dell’ossido nitrico.

È un importante messaggero di molti processi di trasduzione del segnale si lega e attiva la guanilato ciclasi solubile L’arginina è il precursore dell’ossido nitrico

CH2 CH O NO2 Nitroglicerina L’NO è un vasodilatatore prodotto dalle cellule endoteliali in risposta ad una grande varietà di agenti L’NO prodotto dai neuroni causa la dilatazione delle arteie cerebrali NO prodotto dai leucociti si combina con il superossido per produrre il radicale ossidrilico, fortemente reattivo, che uccide i batteri invasori.

FUMARATE ASPARTATE Alpha-keto-acid Il ciclo dell’urea e quello dell’acido citrico e la transamminazione dell’ossalacetato sono collegati tra loro mediante il fumarato e l’ aspartato

Carenza degli enzimi del ciclo dell’urea i neonati con un difetto in uno dei primi 4 enzimi del ciclo sembrano normali alla nascita ma presto diventano letargici, ipotermici e manifestano problemi respiratori. Segue edema cerebrale, coma e morte. Una carenza di arginasi (ultimo enzima del ciclo) provoca sintomi meno gravi. I soggetti interessati devono essere sottoposti a emodialisi cui si associa un trattamento con sodio benzoato e fenillattato per via endovenosa; queste sostanze si condensano con la glutamina formando composti solubili che sequestrano l’ammoniaca in una forma atossica che può essere eliminata con le urine.