Antagonista competitivo Antagonista non competitivo Superagonista Agonista parziale Antagonista competitivo Antagonista non competitivo Antagonista irreversibile Potenza Efficacia Affinita’

? Risposta Efficacia EC50 Potenza ~ sigmoidale 0.1 1 10 1000 10000 100 50 100 0.1 1 10 1000 10000 EC50 Potenza Efficacia ~ sigmoidale

D + R DR Risposta

Binding R tessuto, membrane ligando radioattivo R R R Separazione Filtrazione, centrifugazione R Quantificazione

R R R R R R R R R Non-specifico (in presenza di un eccesso di Farmaco non radioattivo) Totale (come prima) R R R R R R R R R Legame specifico = legame totale - legame non specifico

R R R R R Protocollo di binding (tipo 1) ([crescenti] di radioattivo + tutti i non-specifici rispettivi

Siti infiniti e non saturabili totale Siti saturabili (Specifico) Siti infiniti e non saturabili (non specifico)

R R R R R R totale Non-specifico musc musc musc musc Acetilcolina radioattiva Acetilcolina Radioattiva + Eccesso di muscarina R musc musc nic nic R nic R nic R nic R nic Recettori muscarinici = totale legato da R - non-specifico in presenza di musc

Autoradiografia per scoprire la distribuzione di proteine di membrana o intracellulari

La PET come limite estremo di binding

Quando [DR] = [R] allora Kd = [D] Ka = 1 Ka Kd = Affinita’ [D][R] [DR] Kd = Quando [DR] = [R] allora Kd = [D]

D + R DR (a) (1 - a) a [D] - [D]a KA = KAD - KADa = a KAD = a + KADa R + DR e’ un numero costante. Quindi vi sara’ una concentrazione di D con la quale tutti i recettori saranno occupati. Questo proprieta’ viene definita saturazione a [D] - [D]a KA = KAD - KADa = a KAD = a + KADa KAD = a + KADa

[DR] + KA[D][DR] = [RT]KA[D] Lo Scatchard plot Proporzione dei recettori legati KA[D] 1 +KA[D] a = [DR] [RT] KA[D] 1 +KA[D] = [DR] + KA[D][DR] = [RT]KA[D] = [RT]KA - KA[DR] [DR] [D] = -KA([DR] - [RT]) [DR] [D]

= -KA([DR] - [RT]) [DR] [D] [DR] [D] Pendenza = - KA RT [DR]

Scatchard Plot Ka (-pendenza) LEGATO/ LIBERO Bmax LEGATO

A C B Legato/Libero (dpm/nM) Legato (dpm)

Avete appena scoperto un nuovo metodo per ottenere cellule dissociate da un organo ma dovete caratterizzare il sistema per confermare che queste cellule si comportano in maniera uguale al tessuto originale. Per fare questo, utilizzate N-metil-scopolamina (3H-NMS) ed una sospensione di cellule intatte (100,000 cellule per tubo). Affinita’ ed il numero di recettori per cellula. [3H-NMS] pM legame specifico (fmol/tubo) 20 0.24 50 0.51 100 0.80 200 1.14 500 1.54 1000 1.74

I due tipi di binding: tipo I e tipo II Saturazione Competizione [X*] [X*] [3X*]

R R R R R R R R R R R Protocollo di binding (tipo 2) Radioattivo fisso e [crescenti] di spiazzante non radioattivo Non specifico [R] R [R] + F R [R] + 10F [R] +1000F R R R R R R R R R Perche’ utilizzare questo protocollo???

Binding R tessuto, membrane ligando radioattivo R R Separazione Filtrazione, centrifugazione R Quantificazione

Esempio di binding (II) CONCENTRAZIONE DI RADIOATTIVO COSTANTE; INCREMENTO DI SPIAZZANTE Curva di inibizione

A* + R AR B + R BR KA = [AR] [A][R] KB = [BR] [B][R] [AR] = KA[A][R] [BR] = KB[B][R] RT = [R] + [AR] + [BR] = [R] + KA[A][R] + KB[B][R] = [R](1+ KA[A] + KB[B]) RT KA[A]RT [R] = (1+ KA[A] + KB[B]) [AR] = (1+ KA[A] + KB[B]) KA[A]RT [AR] RT = (1+ KA[A] + KB[B])

[AR] RT KA[A]RT (1+ KA[A] + KB[B]) = IC50 0.5 KA = 1 + KB[B]* IC50 Se KA e KB sono uguali: KA = 1 IC50 - D*

Esempio di binding (II) Legame a 0.1 nM di radioattivo N.S. Legame specifico: 3500 - 500 = 3000 D* = 0. 1 nM IC50 = 0.2 nM KA = 1 IC50 - D* DR [D*] K = A RT [*D] K + 1 A Una delle prime formule che abbiamo visto

L’NAADP e’ un possibile secondo messaggero. Per dimostrare Proviamo L’NAADP e’ un possibile secondo messaggero. Per dimostrare che possiede recettori specifici intracellulari, e’ stato sintetizzato [32P]NAADP ad una attivita’ specifica di 800 Ci/mmol. Il binding e’ stato fatto con concentrazione fissa di [32P]NAADP (50 pM),100 µg di proteina e concentrazioni crescenti di NAADP. [NAADP] pM DPM