ANIMALI TRANSGENICI : definizione Animali transgenici: animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso di specie diverse.

Vettori retrovirali (terapia genica) Microiniezione del DNA nel pronucleo maschile (in zigoti fertilizzati) Cellule staminali embrionali (trasfezione/elettroporazione blastocisti)

Cellule staminali embrionali TOPO CHIMERA

eterozigote o omozigote È necessario selezionare la progenie per avete topi con un genotipo omogeneo eterozigote o omozigote P1 P2 P3 P1 Il topo chimerico (P1) puo’ avere la mutazione nella linea germinale (in eterozigosi) oppure no. In P3 l’assortimento genotipico segue le regole mendeliane per l’incrocio tra due eterozigoti

GFP ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trapping KO condizionali Trasferimento del nucleo YAC GFP

inserzione in una cassetta CASUALE Gene targeting: STRATEGIE PER LA PRODUZIONE DI ORGANISMI TRANSGENICI Gene trapping: inserzione in una cassetta CASUALE Gene targeting: inserzione in un gene SPECIFICO mutagenesi MIRATA

GENE TRAPPING Per fare topi transgenici su vasta scala generalizzata, senza un solo target...ma anche per identificare nuovi geni “Gene trapping is a form of insertional mutagenesis specifically designed to disrupt gene function by producing intragenic integration events”.

Integrazione casuale nel genoma di un costrutto contenente un gene reporter (entrapment vector) Integrazione “produttiva” porta il gene reporter sotto la regolazione trascrizionale di un gene endogeno

Il GENE TRAPPING 1) Consente l’isolamento di nuovi geni 2) Consente la determinazione del profilo di espressione del gene intrappolato 3) È mutagenico: produce knockout X-gal staining of E9.5d embryo showing reporter gene expression associated with a secretory trap insertion in a novel gene. Courtesy K. Pinson

STRATEGIA DEL GENE TRAP Scelta opportuna del vettore e del sistema di trasferimento Selezione dei cloni tramite “marker” Localizzazione dell’inserto nel clone selezionato ANALISI DEL FENOTIPO

ELEMENTI necessari per gene trap: Cellule staminali embrionali di Topo o Uomo “Entrapment vector” contenente : - gene reporter - marker di selezione

Cellule staminali embrionali di Topo Integrazione Sito specifica SELEZIONE di ES CELLS con TRANSGENE integrato nel sito corretto

Geni reporter The E.coli lacZ gene (produzione di beta-Gal) The firefly luciferase gene The jelly fish green flourescence protein (GFP) gene “Lac Z staining”: colorazione istochimica che rivela la presenza della beta-galattosidasi. Questo enzima, in presenza del substrato X-Gal, produce un prodotto insolubile di colore BLU. Questo metodo visualizza la presenza della beta-galattosidasi sia nell’organo “in toto” sia in specifici tessuti/cellule.

per espressione di un gene e Elementi importanti per espressione di un gene e utilizzati per il GENE TRAPPING Enhancer corte sequenze che stimolano l’attività trascrizionale di un promotore Promotore combinazione di elementi ai quali si lega l’RNA polimerasi per iniziare la trascrizione di un gene Poliadenilazione aggiunta di circa 200 A all’estremità 3’ di un mRNA. La coda poly(A) è importante per la stabilità dell’mRNA

Vettori utilizzati per il GENE TRAPPING Enhancer trap Vector Promoter trap V. poly A trap V. Gene trap V.

Enhancer Trap Vector neo neo neo Endogenous gene X P' lac Z Promotore Promotore e pA INDIPENDENTI P' lac Z neo Promotore MINIMO pA pA Exon 1 Exon 2 Exon 3 Enhancer Vector Integration DNA lac Z Promotore MINIMO neo lac Z neo RNA protein PROTEIN X β-gal NeoR

Promoter Trap Vector lac Z neo lac Z neo neo lac Z Endogenous gene X Promotore e pA INDIPENDENTI PROMOTORE Promotore ASSENTE P' lac Z neo pA pA Vector Integration DNA lac Z neo RNA neo lac Z protein PROTEIN X β-gal NeoR

Poly A Trap Vector lac Z neo lac Z neo lac Z neo Endogenous gene X P' Promotore e pA INDIPENDENTI Endogenous gene X P' lac Z neo SA SD Vector Integration lac Z neo SA DNA pA SA lac Z neo RNA pA protein PROTEIN X β-gal NeoR

Gene Trap Vector SA SA lac Z neo SA lac Z neo lac Z neo NeoR Promotore e pA INDIPENDENTI Endogenous gene X Promotore ASSENTE P' lac Z neo SA pA pA Introne gene X Vector Integration lac Z neo DNA SA Spliced transcript lac Z neo RNA SA protein PROTEIN X NeoR β-gal Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE

Gene Trap

RICAPITOLANDO………….. Il GENE TRAPPPING consente Identificazione NUOVI GENI Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO) ANALISI dell’ESPRESSIONE di GENI

PREMIO NOBEL per la MEDICINA 2007 GENE TARGETING PREMIO NOBEL per la MEDICINA 2007 Motivazione: for their work on "principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells and gene targeting.” Mario R. Capecchi Oliver Smithies Martin J. Evans

GENE TARGETING Mutagenesi MIRATA mediante ricombinazione omologa in cellule ES Permette la creazione di una mutazione in un gene PREDETERMINATO Questa mutagenesi può avere come risultato: INATTIVAZIONE dell’espressione di un gene (KNOCK-OUT) DIMINUZIONE dell’espressione di un gene (KNOCK-DOWN) INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (correzione) (KNOCK-IN) IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA

IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA Nelle cellule di Mammifero la RICOMBINAZIONE OMOLOGA è un evento MOLTO RARO (a differenza del Lievito) La frequenza di questo evento aumenta se il grado di OMOLOGIA di sequenza tra il DNA introdotto (esogeno) e il GENE BERSAGLIO (endogeno) è molto elevata Per questo il clone di DNA esogeno è una sequenza ISOGENICA (derivante dallo stesso ceppo murino)

vettori utilizzati per GENE TARGETING VETTORI DI INSERZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-OUT) 2) VETTORI DI SOSTITUZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-IN) Gene di interesse Singolo evento di ricombinazione Distruzione del locus genico: KO M: marker esterno alla regione omologa Gene di interesse Doppia ricombinazione Sostituzione di parti del locus genico Per correggere un gene Per produrne forma inattiva M: marker interno alla regione omologa

DOPPI e TRIPLI KNOCK-OUT Un topo KO per un gene X non sempre ha “fenotipo” Per effetto di RIDONDANZA GENETICA (presenza nel genoma di altri geni con funzione simile) PER QUESTO PUO’ ESSERE NECESSARIO PRODURRE DOPPI/TRIPLI KO DOPPI e TRIPLI KNOCK-OUT

La famiglia delle Serin-treonine chinasi PIM …esempio di TRIPLO KO……… La famiglia delle Serin-treonine chinasi PIM Ruolo di PIM

Solo il triplo KO ha un fenotipo PIM1 KO: nessun FENOTIPO PIM2 KO: nessun FENOTIPO PIM3 KO: nessun FENOTIPO Solo il triplo KO ha un fenotipo “Mice Deficient for All PIM Kinases Display Reduced Body Size and Impaired Responses to Hematopoietic Growth Factors”

…esempio di KNOCK-IN……… ? Qual è l’importanza della FOSFORILAZIONE della proteina ribosomale S6??? Ruvinsky I. et.al. Genes Dev. 2005;19:2199-2211

Ribosomal protein S6 phosphorylation is a S6K1 KO: rpS6 fosforilata! S6K2 KO: rpS6 fosforilata! S6K1/K2 doppioKO: rpS6 fosforilata! ……..esiste un’altra chinasi (o piu’ di una!!) Unica soluzione……..RPS6 KNOCK-IN non fosforilabile Ribosomal protein S6 phosphorylation is a determinant of cell size and glucose homeostasis

MUTAGENESI CHIMICA/FISICA Mutagenesi RANDOM LABORIOSA ANALISI FENOTIPO E IDENTIFICAZIONE GENE MUTATO PER CORRELARE GENE/FENOTIPO Mutagenesi chimica: ENU (Etil-Nitrosurea) EMS (Etil-Metilsolfonato) Mutagenesi fisica : raggi X

CONFRONTO TECNICHE MUTAGENESI CHIMICA GENE TARGETING GENE TRAPPING

G 19/03: PRESENTAZIONE + Lez1 ANIMALI TRANSGENICI G 26/03: OGM (Prof. Gravina)Lez1 G 02/04: OGM (Prof. Gravina)Lez2 G 09/04: Lez2 ANIMALI TRANSGENICI ***consegna articoli G 16/04: Lez3 ANIMALI TRANSGENICI G 23/04: Lez4 DROSOPHILA G 30/04: Lez5 PIANTE G 07/05: Lez6 PIANTE (3 a lezione) 15m ognuna G 14/05: PRESENTAZIONI 1A 1B 1C (topi tecniche) G 21/05: PRESENTAZIONI 2A 2B 2C (topi KO K-In) G 28/05: PRESENTAZIONI 3A 3B 3C (topi KO K-In) G 04/06: PRESENTAZIONI 4A 4B 4C (Drosophila) G 11/06: PRESENTAZIONI 5A 5B 5C (piante)