Costanti di ionizzazione

MODALITA’ DI PREPARAZIONE DI SOLUZIONI TAMPONE

5.07 0.30 4.77 log 2 pH= 4.77 0.10 0.20 log COOH] [CH ] COO pK pH = + Esempio: calcolare il pH di una soluzione tampone che contiene CH3COOH 0,10 M e CH3COONa (acetato di sodio) 0,20 M. Ka dell’acido acetico = 1.7 x 10-5 In soluzione acquosa il sale acetato di sodio si dissocia come segue: CH3COONa(s)  CH3COO-(aq) + Na+(aq) per cui la concentrazione CH3COO- (la base) in soluzione risulta pari a 0.20 M Il pKa dell’acido acetico è: Applicando l’equazione di Henderson-Hasselbalch si ottiene: 5.07 0.30 4.77 log 2 pH= 4.77 0.10 0.20 log COOH] [CH ] COO pK pH 3 a = + -

8.95 0.30 9.25 log 0.5 pH= 9.25 0.2 0.1 log ] [NH pK pH = - + Esempio: calcolare il pH di una soluzione tampone che contiene NH3 0.10 M e NH4Cl 0.20 M. Kb di NH3 = 1.8 x 10-5 In soluzione acquosa il sale cloruro di ammonio si dissocia come segue: NH4Cl(s)  NH4+(aq) + Cl-(aq) per cui la concentrazione di NH4+ (l’acido) in soluzione risulta pari a 0.20M Sapendo che Kw= Ka x Kb → Ka= Kw/Kb Ka = 1.0 x 10-14/1.8 x 10-5 = 5.6 x 10-10 il pKa è 9,25 Si applica poi l’equazione di Henderson-Hasselbalch: 8.95 0.30 9.25 log 0.5 pH= 9.25 0.2 0.1 log ] [NH pK pH 4 3 a = - +

Esempio: calcolare il rapporto fra la concentrazione di acido acetico e di ione acetato necessari per preparare una soluzione tampone a pH 4,9. pKa dell’acido acetico = 4,77 Applicando l’equazione di Henderson-Hasselbalch si ha: Ciò vuol dire che per ogni mole di acido acetico è necessario aggiungere 1,35 moli di acetato di sodio

Esempio: calcolare il pH e la M della soluzione tampone preparata miscelando 20ml di NaOH 0,2M e 50ml di CH3COOH 0,1M moli NaOH = 0,02L x 0,2mol/L = 4·10-3 moli moli CH3COOH= 0,05L x 0,1mol/L = 5 ·10-3moli CH3COOH +NaOH  CH3COO- + Na+ + H2O (5mmol) (4mmol) (4mmol) (4mmol) (4mmol) (5-4=1mmol) Volume finale = 70ml [CH3COOH] = 1/70 = 0,014 M [CH3COO-] = 4/70 = 0,057 M

Applicando l’equazione di Henderson-Hasselbalch si ottiene: COOH] [CH ] COO log 4,77 pH 3 - + = log 4,77 pH + = 0,057 0,014 pH= 4,77+ 0.6 = 5,37 La M del tampone preparato è: M = 5 mmoli (4 mmol CH3COO- +1 mmol CH3COOH)/70 ml = 0,0714M

Procedure di preparazione di una soluzione tampone Una soluzione tampone è sempre costituita da un acido debole HA e dalla sua base coniugata A- oppure da una base debole B e dal suo acido coniugato B+. Le soluzioni tampone possono essere preparate in vari modi:

PROCEDURA SPERIMENTALE I campioni da separare in SDS-PAGE vengono prima fatti bollire per 5 minuti in un tampone (sample buffer) contenente SDS e β-mercaptoetanolo E’ stato dimostrato empiricamente che affinchè tutte le proteine siano rivestite uniformemente con SDS è sufficiente una concentrazione di SDS dello 0,1% (peso/vol) L’SDS è aggiunto nel sample buffer, nello stacking gel e nel resolving gel Il sample buffer contiene anche un colorante tracciante ionizzabile (blu di bromofenolo), il quale consente di seguire l’andamento della corsa elettroforetica Sono presenti inoltre saccarosio e glicerolo, i quali hanno la funzione di rendere più densa la soluzione del campione, consentendo di stratificare senza problemi il campione sul fondo del pozzetto di caricamento del gel dove è presente il tampone di corsa Il blu di bromofenolo, essendo una molecola molto piccola, non subisce alcun effetto frizionale per cui rappresenta il fronte del gel L’elettroforesi termina, e dunque viene tolta la corrente, quando il blu di bromofenolo raggiunge il fondo del gel

PER PREPARARE IL GEL SI OPERA NEL SEGUENTE MODO... Il gel di separazione, generalmente lungo 10 cm, è polimerizzato all’interno di due lastrine di vetro, separate tra loro da due spaziatori di Teflon spessi 1,5 mm Lo stacking gel è versato sopra il gel di risoluzione e vi si inserisce un pettine per formare i pozzetti per il caricamento dei campioni Lo stacking gel è generalmente lungo 1 cm