Trattamento dei campioni biologici l’analisi degli acidi nucleici Biologia Molecolare Clinica aa 2007/2008 Trattamento dei campioni biologici per l’analisi degli acidi nucleici Renata Paleari Università degli Studi di Milano

Fase pre-analitica Percorso pre-analitico del campione - prelievo La rigorosa applicazione delle corrette modalità di prelievo, trasporto, trattamento e conservazione del campione è condi- zione preliminare ed essenziale per garantire l’attendibilità dei risultati ottenuti con le tecniche di biologia molecolare. Percorso pre-analitico del campione - prelievo - conservazione (temperatura, tempo) - trasporto - trattamento del campione (estrazione acidi nucleici) - conservazione acidi nucleici

Errore pre-analitico Errore introdotto: Errore non eliminato: - contaminazione crociata (falsi positivi) - frammentazione DNA per errata manipolazione Errore non eliminato: - inibitori della reazione di amplificazione

Prevenzione contaminazione (1/2) Suddivisione fisica aree di lavoro 1. Area di preparazione del campione (isolamento cellule, estrazione a. nucleici) 2. Area di preparazione della reazione della PCR (preparazione soluzioni, aliquote, mix reazione) 3. Area di amplificazione e analisi degli amplificati (PCR, EF, tecniche ibridazione, sequenziamento) Comportamenti operatore - muoversi secondo il flusso area1--->area2--->area3 - mai entrare nell’area 1 o 2 con prodotti amplificati - lavorare con i guanti (che vanno cambiati quando si cambia area)

Prevenzione contaminazione (2/2) Organizzazione del lavoro - distribuzione materiale in funzione del tipo di lavoro (pipette, puntali, accessori differenti per ogni area) - strumentazione dedicata per ogni area - vetreria sterilizzata, materiale usa e getta - puntali con filtro (contaminazione canale pipette con aerosol contenenti a. nucleici) - soluzioni suddivise in piccole aliquote - pulizia superfici lavoro e apparecchiature con soluzioni decontaminanti (ipoclorito 2%)

Frammentazione del DNA Danneggiamento a causa sollecitazioni meccaniche - maneggiare con delicatezza - no vortex a velocità elevata - no pipettamento eccessivo e vigoroso Digestione da parte di nucleasi cellulari - lavorare con i guanti - soluzioni e materiali sterili - soluzioni contenenti EDTA Azione metalli pesanti (rottura legami fosfodiesterici)

Inibitori della reazione della PCR In quasi tutti i campioni biologi sono presenti sostanze con azione inibitoria sulla PCR che devono essere eliminate nella fase di preparazione del campione. Hb e suoi prodotti di degradazione Metalli pesanti (Fe++) Proteine Lactoferrina Complessi polisaccaridici Eparina

TIPO DI CAMPIONE Sangue (leucociti) Tessuti (biopsie, in paraffina, villi coriali) Liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL) Liquidi biologici: - urina - liquor - saliva - liquido amniotico - liquidi cavitari Bulbo di capello

Fase di preparazione del campione Scopo: ottenere materiale in condizioni ottimali per indagini di tipo molecolare Requisiti: - Non danneggiare: non introdurre errori - Rilasciare ac. nucleici - Concentrare: ottenere una quantità adeguata di a. nucleici - Eliminare inibitori PCR - Stabilizzare: tempo, temperatura, luce deteriorano

Separazione dei leucociti da sangue (buffy coat) - Sangue in EDTA (5 mL) - Centrifugazione (1000 g, 10 min, temp ambiente) - Prelievo buffy coat - Lisi RBC (1 mL ammonio cloruro, K bicarbonato, EDTA, pH 7.4) - Centrifugazione, scartare il surnatante - Lavaggi con PBS - Pellet di leucociti - Conservare a -20 °C

Separazione dei linfociti da sangue Centrifugazione in gradiente di densità di FICOLL - Diluizione sangue (1:2 con PBS) Stratificazione sangue su FICOLL (d=1.077 g/mL) Centrifugazione (1000 g, 30-40 min, 20°C) 4 strati: - plasma - anello di linfociti - FICOLL - RBC sul fondo - Raccolta linfociti - Lavaggi, conservare a –20°C

Preparazione altri tipi di campione Urina, liquidi cavitari: - centrifugazione (separazione componente cellulare e frazione liquida) Liquor: - concentrazione (molecole PM>100 dalton) Campioni delle vie respiratorie (BAL, espettorato): - fluidificazione con enzimi mucolitici - concentrazione delle cellule (centrifugazione) Campioni da biopsie: - disgregazione tessuto (bisturi, omogenizzatore) - eventuale lisi RBC presenti

Conservazione campioni Per estrazione DNA - Sangue: +4°C (24-48 ore) “ -20°C (anni) - Leucociti: -20°C - Pellet: -20°C - Liquor : +4°C trattato: -20°C - Tessuti: N2 liquido Per estrazione RNA - Tutti i campioni a -80°C

Estrazione del DNA Scelta del metodo Metodo ideale - tipo di campione - grado di purificazione richiesto - tecnica impiegata per l’identificazione - tempo richiesto - numero di campioni da processare Metodo ideale - elevata purezza - elevato recupero - sicuro: no reagenti pericolosi - economico - rapida esecuzione

Estrazione del DNA: fasi 1. Lisi cellulare ed inativazione delle nucleasi 2. Purificazione del DNA 3. Precipitazione DNA 4. Valutazione quantitativa DNA estratto 5. Conservazione

1. Lisi cellulare - Disgregazione meccanica: - lisi ipotonica Lo scopo di questa fase è di liberare il DNA dai nuclei e dalle proteine istoniche ed inoltre di inattivare le proteasi - Disgregazione meccanica: - lisi ipotonica - omogenizzazione - Trattamento con agenti chimici: - detergenti (SDS, Sarcosyl, Nonidet P40) - agenti caotropici (urea, ioduro di sodio, guanidina tiocianato) - Digestione enzimatica: - proteinasi K

2. Purificazione DNA - Utilizzo di solventi organici Lo scopo di questa fase è la separazione del DNA dalle componenti cellulari (proteine, lipidi, polisaccaridi) e sostanze interferenti - Utilizzo di solventi organici Fenolo (denatura le proteine) Cloroformio (solubilizza i lipidi) Isobutanolo - Metodo del salting out Utilizza alte concentrazioni saline per rimuovere le proteine (NaCl 6M) - Cromatografia A scambio anionico (matrice carica positivamente) Per adsorbimento (matrice di silice)

3. Precipitazione DNA - Trattamento con alcooli Lo scopo di questa fase è di concentrare, desalificare e recuperare il DNA in forma solida permettendone il successivo ridiscioglimento nella soluzione desiderata - Trattamento con alcooli - etanolo: in presenza di alte concentrazioni di sali monovalenti (sodio acetato, ammonio acetato) - isopropanolo: non richiede alte concentrazioni saline ma è meno facilmente eliminabile dell’etanolo

Purificazione DNA con fenolo-cloroformio Metodo di estrazione classico basato sulla diversa solubilità delle molecole in soluzione (DNA/contaminanti) tra due fasi non miscibili - Lisi campione - 1-10 milioni cellule (si ottengono da 1.0 mL sangue) - Tampone contenente SDS, EDTA, proteinasi K (500 mL) - Overnight 55°C - Estrazione DNA - Trattamento 1:1 con fenolo-cloroformio alcool isoamilico pH 8.0 ( a pH 7.5-8.0 il DNA è nella fase acquosa; a pH 5.0-6.0 il DNA è nella fase organica) - Centrifugazione - 3 fasi: - fase acquosa contenente DNA - interfaccia contenente proteine denaturate - fase organica contenente i lipidi - Prelevare la fase acquosa superiore

- Risospensione DNA precipitato - Precipitazione DNA - Aggiunta etanolo assoluto (1 mL) e tampone ad alta forza ionica (50 mL) (Na acetato 3 M pH 5.2) - Precipitazione DNA (formazione gomitolo) - Centrifugazione a velocità alta (12.000 rpm) - Lavaggio pellet con etanolo 70 %(1 mL) per rimuovere sali in eccesso - Evaporazione etanolo (potente inibitore enzimatico), per almeno 15 min a provetta aperta - Il DNA precipitato e asciutto può essere conservato a -20°C. - Risospensione DNA precipitato - Il DNA viene risospeso in H2O o nel tampone previsto dalla metodica. - Può essere conservato a +4°C per qualche settimana o a - 80°C per molti anni (evitare i congelamenti e scongelamenti ripetuti che danneggiano il DNA)

Purificazione DNA su gel di silice Il metodo è basato sulla proprietà degli a. nucleici di adsorbirsi alla silice, a differenza delle proteine e di altri composti organici - Lisi campione: - con tampone contenente detergenti, proteinasi K, sali coatropici - 56°C per 10 min. - Adsorbimento DNA al gel di silice contenuto in una colonnina - in presenza di etanolo e sali cautropici il DNA si lega alla silice - lavaggi con soluzioni contenenti alcool in grado di rimuovere le proteine denaturate e gli altri componenti cellulari e lasciare il DNA legato alla silice - Eluizione DNA: con H2O o soluzioni a bassa concentrazione salina Nota: il DNA ottenuto è molto puro ma la resa è inferiore rispetto al metodo classico con solventi

4. Valutazione quantitativa DNA estratto Concentrazione DNA - Diluizione in tampone alcalino - Assorbanza 260 nm - DNA, mg/mL= A260 x f.dil x 50 Purezza (contaminazione da proteine) - Rapporto A260/A280 - Purezza ottimale, A260/A280 1.7 - 1.9 dsDNA: 1.0 A = 50 mg/mL ssDNA: 1.0 A = 33 mg/mL RNA: 1.0 A = 40 mg/mL oligo: 1.0 A = 33 mg/mL

1.0 mL sangue intero (5-10 milioni leucociti) Una cellula eucariota contiene: 6 pg DNA, 10-30 pg RNA 25 - 50 mg di DNA PCR: 0.1 - 2 mg DNA

5. Conservazione del DNA RNA sempre a -80°C Il Dna estratto e purificato è in genere risospeso in H2O distillata sterile ultrapura o in soluzioni a bassa concentrazione salina a pH 7.4. +4°C: stabile per alcune settimane -20°C: stabile più a lungo (evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento che possono danneggiare il DNA) -80°C: stabile per molti anni RNA sempre a -80°C

Manipolazione RNA: precauzioni (1/2) Molecola instabile - presenza ossidrile libero in posizione 2’ sul ribosio - idrolisi in soluzione acquosa alcalina Particolarmente suscettibile azione RNasi RNasi estremamente attive - non necessitano di alcun cofattore - molto resistenti alle alte temerature (autoclavaggio) - presenti ovunque (operatore, ambiente lavoro, soluzioni)

Manipolazione RNA: precauzioni (2/2) Inattivazione RNasi endogene (utilizzo inibitori, denaturanti) - Sali di vanadio complessati con ribonucleosidi: inibitore - Rnasina: inibitore specifico - Guanidina isotiocianato: agente denaturante Prevenzione contaminazione RNasi endogene (ambiente Rnasi-free) - Aree lavoro separate con materiali, soluzioni, pipette dedicate - Materiale plastico monouso RNasi-free - Vetreria: - temperatura > 180°C - trattamento con dietil-pirocarbonato (DEPC) 0.1% - autoclavaggio - prodotti commerciali per decontaminazione - Soluzioni: - DEPC 1 mL/L e autoclavaggio - Soluzioni e Kit pronto uso

Estrazione e purificazione RNA L’RNA deve essere estratto il più rapidamente possibile subito dopo la raccolta del campione Lisi cellulare - In presenza di guanidina isotiocianato (agente caotropico) e b-mercaptoetanolo (agente riducente) Purificazione - Trattamento con fenolo-cloroformio pH 5-6 - 3 fasi:- fase acquosa contenente RNA - interfaccia contenente proteine denaturate - fase organica contenente DNA e lipidi Precipitazione - Con isopropanolo, lavaggi con etanolo 75% Risospensione - Con H2O o tampone a bassa forza ionica, conservare a -80°C

Controllo di Qualità Interno Procedure per la realizzazione della qualità - Organizzazione del lab (aree pre- e post-amplificazione separate) - Controllo delle contaminazioni (guanti, materiali monouso) - Strumentazione (manutenzione periodica) - Reagenti (per biologia molecolare, piccole aliquote, data scadenza) - Metodiche (protocollo di lavoro scritto e dettagliato) Strumenti per la verifica della qualità (controlli) - Controlli positivi - Controlli negativi - Bianco di PCR - Controlli di estrazione (campione da paziente noto) - Controlli di amplificazione (a. nucleico già estratto)

Valutazione Esterna di Qualità (VEQ) Tappe essenziali - Ente organizzatore che predispone la VEQ - Partecipanti (laboratori che aderiscono alla VEQ) - Spedizione di materiali e programma ai partecipanti - Analisi dei materiali da parte dei lab - Invio dei risultati - Elaborazione dei dati Diagnostica virologica Disponibili VEQ per alcuni patogeni di rilevanza clinica e larga diffusione e per i quali sono disponibili kit commerciali e parziale automazione, ad es. HBV, HCV, HIV, CMV. Diagnostica genetica Limitati a poche patologie di rilevante impatto clinico e diffusione (es. fibrosi cistica). Più praticabili VEQ che valutino l’accuratezza e l’efficienza delle diverse fasi di un esperimento di PCR (dall’estrazione alla rivelazione). Queste fasi sono comuni a tutte le applicazioni della PCR e possono interessare laboratori con diverse specializzazioni e interessi clinici.

Esempio di un programma di VEQ per l’amplificazione del DNA mediante PCR Materiale inviato - 3 campioni di DNA estratti da leucociti - 1 campione di sangue - 1 coppia di primers - Protocollo di amplificazione da allestire con reagenti e strumenti per PCR del laboratorio Partecipanti 39 laboratori italiani Programma 1. Determinazione della concentrazione e della purezza dei 3 campioni di DNA. 2. Estrazione del DNA dal campione di sangue con la procedura in uso nel lab e stima della quantità e qualità del DNA estratto. 3. Amplificazione mediante PCR del DNA estratto dal campione di sangue e analisi dei risultati mediante eletttroforesi. Raggi, 2003

CV, % 1. Valutazione della quantificazione del DNA DNA,mg/mL A 260/280 128 51 DNA 2 72 15 DNA 3 211 30 Valori di CV calcolati dai risultati inviati dai laboratori per quanto riguarda la concentrazione di DNA e la purezza, misurata sui tre campioni di DNA.

2. Valutazione della metodica di estrazione Concentrazione DNA Purezza DNA DNA, mg/mL Ratio 260/280 nm Labs Labs Mediana: 0.1 mg/mL Min: 0.012 mg/mL Max: 0.54 mg/mL CV: 82 % Mediana: 1.69 Min: 0.8 Max: 2.5 CV: 21 %

3. Valutazione della reazione di amplificazione Analisi dei prodotti di amplificazione (elettrofforesi su gel di agarosio 2 %) 1 2 3 4 5 6 7 8 11 12 13 14 15 16 9 10 Labs Atteso: 1 banda di 280 pb