BRCA1 In quali circostanze è stata identificata? Qual è il suo ruolo fisiologico? Com’è coinvolta nella risposta agli xenobiotici? Cosa può comportare una sua alterazione funzionale? Che ruolo può avere come target farmacologico?

The BRCA1 gene was identified and cloned in 1994 based on its linkage to early onset breast cancer and breast-ovarian cancer syndromes in women. While inherited mutations of BRCA1 are responsible for about 40–45% of hereditary breast cancers, these mutations account for only 2-3% of all breast cancers, since the BRCA1 gene is rarely mutated in sporadic breast cancers. However, BRCA1 expression is frequently reduced or absent in sporadic cancers, suggesting a much wider role in mammary carcinogenesis. (Eliot M. Rosen et al. 2003)

Where? The BRCA1 gene on chromosome 17q12-21 was identified and cloned by Miki et al. (1994)

(Marcelo A. Carvalho et al. 2007) Struttura Domains associated with specific assays or activities are depicted. BRCA1 contains the N-terminal RING domain, nuclear localization signal (NLS), and two C-terminal BRCT domains. (Marcelo A. Carvalho et al. 2007)

Pathway Cell cycle progression, several highly specialized DNA repair processes, DNA damage responsive cell cycle checkpoints, regulation of a set of specific transcriptional pathways, and apoptosis.

Per semplicità The interplay between ERα and BRCA1 pathways and its impact on cell proliferation (1) and genome stability maintenance (2). Solid arrows indicate a direct role while the dashed arrow indicates an indirect pathway (Yanfen Hu 2009)

L’interazione con p53 testimonia il ruolo chiave nella progressione del ciclo cellulare, per la comune espressione di oncosoppressori (p21, p27, Bax). MEF BRCA-/- presentano inoltre una scarsissima proliferazione a meno di un contemporaneo knockout di p53 (Zheng et al., 2001). Stabilità del DNA BRCA1 è coinvolta in ogni meccanismo di riparo del DNA (HR, NHEJ, MR) in misura diversa. La sua presenza nelle foci di riparo insieme a RAD51 è indipendente da altri fattori come H2AX o MDC1. (Roger A. Greenberg 2008)

…by step Step… Chu-Xia Deng 2006

Stabilità del fuso mitotico Tra le funzioni della stabilità genomica mediate da BRCA1 si nota come essa medi la nucleazione del fuso mitotico garantendo la separazione dei nucleotidi fratelli solo quando tutti i cromosomi sono stabilmente “agganciati”. Il modello schematico di come ciò possa accadere è spiegato nella figura in basso. (Chu-Xia Deng 2006) Stabilità del fuso mitotico (C – D) immunofluorescenza Dapi e anticorpi anti-tubulina. (E – F) anticorpi fluorescenti anti H3. (C – F) Brca1D11/D11 (D – F) Brca1wt.

Controllo dell’ER (Estrogen Receptor) BRCA1 targets the conserved C-terminal activation domain (AF-2) of ER-a, since it blocked the ligand-dependent activation of AF-2 in a specific assay of AF-2 dependent transactivation. These findings suggest a mammary tissue-specific function for BRCA1 (Fan et al., 1999a)

Come? Figure 1. The ubiquitination cascade. Figure 2. BRCA1/BARD1 ubiquitinate phosphorylated RNAPII. DNA damage results in the phosphorylation of RNAPII, and BRCA1/BARD1 bind to the phospho-RNAPII to catalyze its ubiquitination. Figure 3. BRCA1-dependent E3 ubiquitin ligase prevents centrosomal hypertrophy. The activity of the BRCA1/BARD1 ubiquitin ligase marks centrosomes as post-duplicated, preventing amplification of centrosome number, a common feature of breast tumors. This activity of BRCA1 also regulates the activity of the centrosome in assembling the microtubule network of the cell. (Lea M. Starita, Jeffrey D. Parvin 2006)

Contro gli xenobiotici? In the present study, we have investigated the effects of BRCA1 on xenobiotic stress-inducible gene expression. In response to aryl hydrocarbon receptor (AhR) ligands, cytoplasmic AhR becomes activated and then translocates to the nucleus where it forms a complex with the aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT). Subsequently, the AhR-ARNT complex binds to the enhancer or promoter of genes containing a xenobiotic stress-responsive element and regulates the expression of multiple target genes including cytochrome P450 subfamily polypeptide 1 (CYP1A1). (Hyo Jin Kang et al. 2006) Un esempio su tutti: AhR

Qual è l’effetto di BRCA1? vale solo per CYP1A e CYP1B? The effect of exogenous BRCA1 on TCDD-induced gene expression. Subconfluent MCF-7 cells transfected with a BRCA1 expression vector or pcDNA3 (empty vector) were incubated for 24 h and then treated with 10 nM TCDD for an additional 24 h. Total cellular RNA was then extracted to measure the relative amounts of CYP1A1 (A) and CYP1B1 (B) by quantitative reverse transcription-PCR. vale solo per CYP1A e CYP1B?

falsasse l’esperimento? NO! Per ogni XRE The effect of exogenous BRCA1 on a XRE-containing promoter in TCDD treated cells. Exponentially proliferating cells (MCF-7 (A), T47D (B), and ZR-75–1 (C)) were transiently transfected with empty vector or the BRCA1 expression vector and a p(XRE-1A1)-Luc reporter plasmid, treated with 10 nM TCDD, and assayed for luciferase. D, MCF-7 cells were transfected with BRCA1 and the p(Cyp1a1)-Luc reporter (34) and treated with 10 nM TCDD, and the promoter activity was monitored. E se TCDD falsasse l’esperimento?

Proviamo a cambiare xenobiotico Il risultato non cambia! The effect of other AhR ligands on the activity of a XRE-containing promoter in the presence of exogenous BRCA1. A, exponentially proliferating MCF-7 cells were transiently transfected with BRCA1 and p(Cyp1a1)-Luc reporter, incubated with AhR ligands, 10 nM TCDD, 1 M DF203, or 1 M 5F203, harvested, and assayed for luciferase activity. Cells (MCF-7 (B) and T-47D (C)) were transfected with BRCA1 or p(XRE-1A1)-Luc reporter plasmid and treated with 10 nM TCDD, 1M DF203, or 1M 5F203 for only 8 h before luciferase activities were assayed. Il risultato non cambia!

Promotore ed espressione

Quando i meccanismi si alterano... Alterazioni di BRCA nello sviluppo del carcinoma mammario

Pathway del complesso AhR-ARNT e ruolo di BRCA TCDD (2,3,7,8-Tetrachlorodibenzodioxin) BRCA1 ?

Alterazione di BRCA GENETICA Mutazioni di BRCA FUNZIONALE Ridotta espressione cellulare

INTERAZIONE BRCA-ARNT

Dove muta il gene di BRCA?

Cosa varia con le forme mutate di BRCA?

Circa l’80% delle donne con mutazioni a carico di BRCA1 o BRCA2 svilupperà il carcinoma della mammella durante la propria vita, con elevati rischi anche per lo sviluppo di carcinoma ovarico. RUOLO DI BRCA NEL RECLUTAMENTO DI RAD50- RAD51 (riparazioni dei danni al DNA da radiazioni)

(non a carattere ereditario). Mutazioni di BRCA1 o BRCA2 sono invece rare o del tutto assenti nei carcinomi mammari sporadici (non a carattere ereditario). Nonostante ciò in questo tipo di tumori si riscontrano comunque alterazioni del pathway di BRCA, dovute soprattutto a modifiche nei suoi livelli di espressione. ALTERAZIONE NELL’ ESPRESSIONE DI BRCA (perdita,totale o parziale, di almeno una copia del gene o inattivazione funzionale dovuta a fenomeni epigenetici, quali la metilazione del promotore)

Cosa cambia in assenza di BRCA?

E ARNT?

BRCA COME TARGET FARMACOLOGICO PREVENZIONE CHEMIOTERAPIA Nelle donne che presentano mutazioni ereditarie nel gene per BRCA. Nelle donne che hanno sviluppato un carcinoma mammario o ovarico e presentano alterazioni nell’espressione di BRCA

Tecniche di prevenzione L’ indotta amplificazione della risposta di ARNT ad uno xenobiotico (TCDD) ripristina i normali livelli di attività XRE anche in assenza di BRCA

Chemioterapia

Inibizione di PARP1 Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase Helen E. Bryant, Niklas Schultz, Huw D. Thomas, Kayan M. Parker, Dan Flower, Elena Lopez, Suzanne Kyle, Mark Meuth, Nicola J. Curtin & Thomas Helleday. 2007

Andamento della crescita di una massa tumorale in presenza di inibitori di PARP1 per topi difettivi di BRCA1 V-C8 (BRCA2 MUTANT) V-C8+B2 (BRCA2 COMPLEMENTED)

Grazie per l’attenzione Chissà, chissà chi sei… chissà che sarai chissà poi che ruolo avrai lo scopriremo solo... STUDIANDO!