Biosintesi proteica in vitro Passato, presente e futuro

Produzione di proteine eterologhe Resa relativa bassa rispetto al potenziale complicate procedure di downstream Misfolding e aggregazioni Degradazione Prodotti tossici Modificazioni delle proteine ESISTONO ALTERNATIVE??

Sistemi in vitro Sono noti da decenni (studi biochimici sulla sintesi proteica…..) Le proteine prodotte (in piccolissima quantità) erano correttamente foldate e attive.

Possibili vantaggi Non richiede sintesi DNA Non richiede clonaggio & trasformazione Aggira legislazione restrittiva Poche esigenze strumentali procedure semplici poco personale poca energia Bassi investimenti Purificazione semplice Rese per unità volume Rapidità Smaltimento residui Proteine tossiche Inserimento aminoacidi non naturali

Potenzialità E. coli duplica in 30’ e ha un contenuto proteico del 15%. 1 litro contenente 1.6 g di cellule produce 500 mg h-1 (3-5000 proteine diverse) Lo stesso apparato biosintetico potrebbe in principio essere forzato a produrre in vitro 1 solo tipo proteico.

La sintesi proteica estratti E. coli commerciale sintesi Uno dei maggiori processi biologici delle cellule 15% della massa cellulare, 80% dell’energia più di 200 molecole diverse coinvolte

Dove troviamo tutto? Frazione S30 Frazione S100 mRNA DNA + RNA polimerasi fagica RNA sintetico trascrizione/traduzione accoppiata E. coli, germe grano, lisato reticolociti, preparazioni commerciali

Possibili applicazioni Proteine di valore (ricerca medica o industria) studiare il folding ( e disegnare proteine migliori) marcatura selettiva di singole posizioni Studi dei trasportatori Sintesi di proteine tossiche Proteine migliori o nuove (modifiche non naturali) Combinazione con PCR per screening di mutanti ed evolvere nuove caratteristiche Chip proteici

E. coli: il più popolare, no capping, ma sistema procariote, problemi di folding, problemi con proteine multidominio (folding cotraslazionale) Reticolociti di coniglio: eucariote, bassa efficienza (codon usage ottimizato per la globina, ribonucleasi molto attiva, elevata concentrazione emoglobina) Embrioni di germe di grano: hanno presente tutto l’apparato di traduzione in uno stato liofilizzato. Bassa durata di reazione

Simultaneous Expression and Maturation of the Iron-Sulfur Protein Ferredoxin in a Cell-Free System 450 mg/L in 6 ore

Folding Folding cotraslazionale, sia in procarioti che in eucarioti Chaperoni (DnaJ/DnaK/GtpE; GroEL/GroES; hsp60; hsp70) Formazione ponti disolfuro corretti ambiente redox adeguato e catalizzatori (disulfide isomerasi eucariotica) Per proteine multimeriche meglio sistemi eucarioti: sono 10 volte più lenti e consentono aggregazioni corrette.

Proteine tossiche

Modifiche non naturali Facilità di alterazione di singoli componenti del sistema traduzionale Estensione del codice genetico studi di stabilità proteica, trasduzione del segnale e meccanismi enzimatici Un tRNA sopressore (riconosce uno stop codon) viene caricato chimicamente o enzimaticamente con un aa non naturale+

Evoluzione Espressione diretta di prodotti PCR random Recupero delle varianti migliori Nuovi cicli di mutagenesi Scanning saturation mutagenesis Analisi di tutte le possibili combinazioni della binding region di un anticorpo Possibilità di automazione del processo Sequenza sintetizzata per PCR, poi trascrizione traduzione in vitro, elisa sui singoli prodotti per identificare effetto di tutte le sostituzioni.

Selezione in vitro da grandi librerie Tecniche di display fagico o su cellule: limitazione dall’efficienza di trasformazione Strategia evoluzionista: le molecole selezionate sono mutagenizzate a ogni round size library > 1012 ribosome display : la proteina folda correttamente ma non lascia il ribosoma “RNA-peptide fusion”: un linker di DNA e puromicina lega il prodotto al suo messaggero. Complessi ternari proteina mRNA e ribosoma (ARM), isolati grazie all’affinità della proteina per qualche recettore. Se recupero il messaggero e lo amplifico con una polimerasi che fa errori, mutagenizzo. Per esempio, parti variabili anticorpi.

se al mRNA manca il codone di stop il ribosoma stalla sull’ultima tripletta. Con puromicina legame covalente: posso applicare selezioni molto più stringenti e dure.

Da migliorare Scale up da ml a litri Durata Rigenerazione energia PURE: prodotti purificati Rimozione prodotti (membrane “intelligenti”) Eterogeneità efficacia messaggeri (ottimizzazione sequenze) Stabilità messaggero mutanti inibitori RNAsi stabilizzazione chimica (nucleotidi acetilati in pos. 2) Prodotti purificati:PURE

sistema “PURE” Other enzymes 4500U/ml MTF 1.2 mM ribosomes 4.0 mg/ml creatine kinase 3.0 mg/ml myokinase 1.1 mg/ml nucleoside-diphosphate kinase 2.0 units/ml pyrophosphatase 10 mg/ml T7 RNA polymerase Energy sources 2mM ATP, GTP 1mM CTP, UTP 20 mM creatine phosphate BuVers 50 mM Hepes–KOH, pH 7.6 100mM potassium glutamate 13 mM magnesium acetate 2mM spermidine 1mM DTT Other components 0.3mM 20 amino acids 10mg/ml 10-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid 56 A260/ml tRNAmix (Roche) Present composition of the PURE system Translation factors 2.7 mM IF1 0.40 mM IF2 1.5 mM IF3 0.26 mM EF-G 0.92 mM EF-Tu 0.66 mM EF-Ts 0.25 mM RF1 0.24 mM RF2 0.17 mM RF3 0.50 mM RRF Aminoacyl-tRNA synthetases

Durata I componenti non devono degradarsi né esaurirsi: Protein Bioreactor In dipendenza dall’mRNA, 3-30 mg/ml in 1 h (max durata 50 ore, fino a 90 mol proteina/mol RNA) ribosome, translation factors, tRNA, aminoacyl tRNA synthetases, template (RNA or DNA), and RNA polymerase Proteine piccole (< 20.000 Da) Estremamente attive amino acids, energy components, NTPs, co-factors. Ottimizzare interazioni messaggero-ribosoma Emivita mRNA: 30s 30’. Rimozione prodotti: problema dimensioni (3-20.000 Da) product, AMP, GDP, Pi, aminoacida..

Altri tipi possibili SFCF: Hollow filter: Nell’ultimo aumenta la superficie filtrante. Possibili anche interazioni di affinità con il prodotto SFCF: il prodotto resta dentro e va separato dalla miscela Hollow filter: grande superficie filtrante

Incremento tempi Aumentare la concentrazioni dei componenti ultrafiltrazione, PEG Cloramfenicol acetil transferasi

Rigenerazione energia Creatina fosfato + creatina fosfokinasi (eucarioti) PEP + piruvato kinasi (procarioti) AcetilP + acetato kinasi (già presente) Forte perdita iniziale energia sia in grano che in coli, indipendente dalla sintesi proteica

Struttura messaggero Capping aumenta stabilità, ma anche incremento concentrazione non-capped mRNA Ottimizzazione interazione col ribosoma e rapporto mRNA/ribosoma agire sulla quantità di templato o di RNA polimerasi Accoppiare trascrizione e traduzione incrementa emivita messaggero (steady state) Aggiunta strutture secondarie in 5’ e 3’

Single Protein Production (SPP) MazF è una tossina di E. coli che degrada il messaggero a livello delle tripletta ACA Induzione MazF  la cellula è una fabbrica cellulare pronta a eseguire qualunque istruzione. Le cellule sono quiescienti, ma con l’apparato metablico pienamente funzionante Induzione di un gene eterologo (pCold) privo di triplette ACA La sintesi prosegue per almeno 4 giorni

SSP Sintesi generale bloccata entro 2 ore dall’induzione MazF Eotaxina umana fino al 30% proteine totali, >96 ore NMR in vivo

Fully automated transcription and translation Fully automated transcription and translation. Capable of producing approx. 4mg* of protein (e.g. GFP) in each of the 8 tubes (or 30mg* in total) in an overnight campaign. *as crude protein Applications: structural analysis, antibodies production Fully automated transcription and translation. Capable of producing approx. 10mg* of protein (e.g. GFP) in each of the 384 wells in an overnight campaign. *as crude protein Applications: high throughput screening, functional analysis

ROCHE RTS500 Anche Promega, Quiagen hanno il loro sistema DNA templates (expression vectors with a T7-RNA polymerase promoter and a ribosomal binding site (RBS)) T7-RNA polymerase for transcription (mRNA synthesis) Special E. coli lysate for translation Anche Promega, Quiagen hanno il loro sistema

“Cell-free protein synthesis: Applications come of age” Biotechnology Advances 30 (2012) 1185–1194 Cell-free protein synthesis has emerged as a powerful technology platform to help satisfy the growing demand for simple and efficient protein production. While used for decades as a foundational research tool for understanding transcription and translation, recent advances have made possible cost-effective microscale to manufacturing scale synthesis of complex proteins. Protein yields exceed grams protein produced per liter reaction volume, batch reactions last for multiple hours, costs have been reduced orders of magnitude, and reaction scale has reached the 100-liter milestone. These advances have inspired new applications in the synthesis of protein libraries for functional genomics and structural biology, the production of personalized medicines, and the expression of virus-like particles, among others. In the coming years, cell-free protein synthesis promises new industrial processes where short protein production timelines are crucial as well as innovative approaches to a wide range of applications.

Sutro Biopharma's Scalable Biochemical Protein Synthesis Platform Designing and Manufacturing a New Generation of Biotherapeutics Sutro Biopharma's technology platform is made possible by the separation, into an extract, of the cellular components required to produce proteins from the process of protein generation itself. The extract includes all the necessary biochemical components for energy production, transcription and translation and can be used to support cell-free biochemical protein synthesis by the addition of the specific DNA sequence for the desired protein. The process produces single proteins at g/L yields in 8-10 hours at any scale. Difficult-to-fold proteins Cytotoxic molecules Non-natural amino-acid containing proteins