MSc project title : Use of biological scaffolds for 3D-modelling analysis and in vitro osteogenic differentiation methods and implementation Candidata: Giovanna Lo Conte Relatore : Dr. Marcello Bracale Correlatori: Dr. Paolo Gargiulo e Dr. Ólafur E. Sigurjónsson

INTRODUZIONE Allo stato attuale della tecnologia il metodo più comune per esaminare le cellule sugli scaffolds è il microscopio elettronico. Esso permette un’analisi 2D della superficie di tali strutture e non permette una visione interna degli scaffolds. Per vedere la parte interna degli scaffold è realizzare un sezionamento seguito da un analisi istologica, ma tale tecnica è distruttiva, noiosa e semi-quantitativa. Questo progetto nasce dall’esigenza di voler superare tali limiti e di voler trovare un nuovo strumento di analisi che consenta di ottenere le informazioni delle tecniche attualmente utilizzate in maniera non distruttiva e quantitativa.

OBIETTIVI Il primo obiettivo è vedere se con la tecnologia della µCT è possibile monitorare i cambiamenti intracellulari che avvengono su differenti tipi di scaffolds OPLA (open-cell polylactic acid) e CaP (Calcium Phosphate) inseminati da cellule mesenchimali staminali MC3T3-E1. Il secondo obiettivo è la progettazione di uno scaffold che consenta l’ottimizzazione della crescita in vitro delle ossa e realizzazione di un prototipo dello scaffold usando una stampante 3D. Scaffold CaP Gli obiettivi principali del mio progetto sono essenzialmente due: 1) stabilire metodi di analisi tridimensionale del differenziamento osteogenico di cellule staminali MC3T3-E1 su scaffolds porosi OPLA e CaP. Vedere quindi se è possibile monitorare in ambiente di imaging processing l’evoluzione intracellulare lavorando su immagini (ottenute con la microCT) di scaffolds in ambiente mimics [ valutando le differenze con i risultati ottenuti col microsopio.] 2) Il secondo obiettivo è quello di studiare le forme degli scaffolds e pensare a un ottimizzazione del design per quanto riguarda la sollecitazione meccanica in bioreattori, perché partiamo dal presupposto che riusciamo a catalizzare la dinamica di crescita cellulare attraverso la stimolazione meccanica.* Quindi vogliamo ottimizzare il design e successivamente realizzare un prototipo dello scaffolds usando una stampante 3D.

METODO: Set up MC3T3-E1 Le cellule staminali MC3T3-E1 sono una linea cellulare proveniente da un piccolo roditore (Mus Musculus). Queste cellule staminali, dopo un programma di differenziazione degli osteoblasti in vitro, possono produrre una matrice mineralizzata come quella ossea[2]. Le cellule staminali MC3T3-E1 sono coltivate in un medium di coltura (α-MEM), senza acido ascorbico, con l’aggiunta del 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di antibiotico (contenente penicillina) Vi spiego brevemente la procedura che ho attuato per l’inseminazione. Le cellule (aderenti) sono coltivate in un medium di coltura (α-MEM=minimum essential media), senza acido ascorbico (vitamina idrosolubile antiossidante che svolge nell'organismo molteplici funzioni, induce la produzione di collagene), con l’aggiunta: del 10% di siero fetale di bovino (FBS) che contiene fattore di crescita e proteine con funzioni di trasporto e 1% di antibiotico (contenente penicillina) per eliminare la presenza id eventuali batteri. Queste cellule sono fatte espandere (cioè moltiplicare) per 7 gg cambiando il terreno di coltura ogni 2 gg. MC3T3-E1 al microscopio [2] Jane B. Lian, Victoria Shalhoub, Fauzia Aslam, Baruch Frenkel, Jack Green, Michael Hamrah, Gary S. Stein and Janet L. Stein (1997): Species-Specific Glucocorticoid and 1,25-Dihydroxyvitamin D Responsiveness in Mouse MC3T3-E1 Osteoblasts: Dexamethasone Inhibits Osteoblast Differentiation and Vitamin D Down-Regulates Osteocalcin Gene Expression .1997 May;138(5):2117-27

METODO: Set up scaffolds Prima della semina delle cellule sugli scaffold, essi sono disposti in un multiwell con 24 pozzetti, sono bagnati con una soluzione di PBS (tampone fosfato salino) e fibronectina (che induce l’attaccamento delle cellule su di essi) e poi sono incubati per un ora. Per la semina degli scaffolds sono usate approssimativamente 200.000 cellule in una soluzione di volume totale di 150 µl.

METODO : differenziazione osteogenica Le cellule inseminate sugli scaffolds sono coltivate con un media per la differenziazione osteogenica (D-MEM/F12) con l’aggiunta di acido ascorbico (che induce la formazione di collagene), β-glycerolphasfate (che induce la calcificazione del collagene) e siero fetale bovino (FBS). La cultura è mantenuta in un incubatore a 37° in un atmosfera umidificata contenente 5% CO2 e il media è cambiato ogni due giorni. dopo 2 giorni

ANALISI SUPERFICIE SCAFFOLD CON IL MISCROSCOPIO Risultati preliminari (scaffold con cellule dopo 3 settimane) Scaffold CaP con cellule al microscopio Il microscopio invertito è un microscopio con la sorgente di luce ed il condensatore posti in alto, al di sopra del tavolino portaoggetti, mentre gli obiettivi e la torretta si trovano al di sotto del tavolino portaoggetti. Il microscopio invertito è utilizzato per osservare cellule viventi o organismi al fondo di un grande contenitore (ad esempio, una coltura di tessuti in una apposita fiasca) in condizioni naturali difficilmente realizzabili con un normale vetrino utilizzato con un microscopio convenzionale. Questo microscopio è in genere equipaggiato di un dispositivo per il contrasto di fase per andare ad osservare le cellule mantenute in vita nelle colture in vitro; infatti tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi non utilizzabili nelle tecniche di coltura cellulare e tissutale. Leica DM-IRB Inverted Research Microscope

ANALISI CELLULE E MATRICE CON IL MISCROSCOPIO Risultati preliminari (scaffold con cellule dopo 3 settimane) Scaffold CaP con cellule al microscopio dopo il sezionamento e la colorazione

ANALISI CALCIFICAZIONE CON IL MISCROSCOPIO Risultati preliminari (scaffold con cellule dopo 3 settimane) Scaffold CaP con cellule al microscopio dopo il sezionamento e la colorazione Il microscopio invertito è un microscopio con la sorgente di luce ed il condensatore posti in alto, al di sopra del tavolino portaoggetti, mentre gli obiettivi e la torretta si trovano al di sotto del tavolino portaoggetti. Il microscopio invertito è utilizzato per osservare cellule viventi o organismi al fondo di un grande contenitore (ad esempio, una coltura di tessuti in una apposita fiasca) in condizioni naturali difficilmente realizzabili con un normale vetrino utilizzato con un microscopio convenzionale. Questo microscopio è in genere equipaggiato di un dispositivo per il contrasto di fase per andare ad osservare le cellule mantenute in vita nelle colture in vitro; infatti tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi non utilizzabili nelle tecniche di coltura cellulare e tissutale.

SCANSIONE CON µCT E RICOSTRUZIONE 3D Risultati preliminari (scaffold con cellule dopo 3 settimane) Scaffold CaP dopo la ricostruzione 3D con datos|x Caratteristiche da indagare dopo 8 settimane: -struttura 3D dello scaffold -dimensione dei pori - proprietà dell’attaccamento delle cellule allo scaffold -distribuzione della formazione della matrice mineralizzata (mineralizzazione) The phoenix nanotom® s is the first 180 kV / 15 W nanofocus computed tomography system perfectly tailored to applications e.g. in material science, precision injection moulding, micromechanics, electronics geology and biology. With its 180 kV / 15 W ultra high performance nanofocus X-ray tube, precision mechanics and advanced software modules, the nanotom® is the inspection solution for a wide range of 3D CT applications. Once scanned, the fully three dimensional CT information allows many possibilities for analysis, e.g. non-destructive visualization of slices, arbitrary sectional views, or automatic pore analysis. Key Features First 180 kV / 15 W nanoCT® system with low maintenance, longlife open X-ray tube High precision rotation-unit with air bearing for accurate and reliable CT images Granite-based manipulation and optional thermal stabilization for long-term stability and highest precison Up to 2 times faster data acquisition at the same high image quality level by diamond|window (optionally) Customer Benefits 4 operation modes from submicron to high-intensity applications Automated generation of first article inspection reports in < 1 hour possible Excellent software modules for highest CT quality and ease of use, e.g. High precision and reproducible 3D metrology by click & measure|CT with datos|x 2.0: fully automated execution of CT scan,reconstruction and analysis process Accelerated 3D CT reconstruction results within a few seconds or minutes (depending of the volume size) by velo|CT Very compact system even for small labs µCT Phoenix Nanotom s GE software phoenix datos|x

METODO Definito un protocollo di scansione degli scaffolds Definito un protocollo di ricostruzione 3D degli scaffolds Usando lo standard DICOM (Digital Imaging and COmmunications in Medicine) per portare i dati dell’ immagini 3D in ambiente Mimics. Sarà necesario stabilire un protocollo per l‘analisi 3D di tali strutture in ambiente Mimics, per poter ricavare informazioni e confrontarle con quelle delle tecnologie attualmente usate. Dati scansione  V=120kV I=100µA T=2000ms

OTTIMIZZAZIONE E PROTOTIPIZZAZIONE Nella seconda parte del mio lavoro, partendo dall'ipotesi[3] che è possibile riuscire a catalizzare la dinamica di crescita cellulare attraverso la stimolazione meccanica, voglio ottimizzare il processo modificando le caratteristiche degli scaffolds (forma, porosità, materiale). Voglio realizzare, infine, un prototipo dello scaffold usando una stampante 3D (ZPrinter 450) che è in grado di generare modelli tridimensionali partendo da disegni realizzati usando dei programmi di modellazione. Il secondo obiettivo è quello di studiare le forme degli scaffolds e pensare a un ottimizzazione del design per quanto riguarda la sollecitazione meccanica in bioreattori, perché partiamo dal presupposto che riusciamo a catalizzare la dinamica di crescita cellulare attraverso la stimolazione meccanica.[1] Vogliamo ottimizzare il design dello scaffold e successivamente realizzare un prototipo dello scaffolds usando una stampante 3D. [3] Ulrich Meyer, Thomas Meyer, Jorg Handschel, Hans Peter Wiesmann (2009) Fundamentals of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Springer-Verlag Berlin Heidelberg

Grazie per l’attenzione! 