Parvovirus B19 e Papillomavirus umani Università di Bologna Dipartimento di Medicina Clinica Specialistica e Sperimentale Sezione di Microbiologia Tecniche di amplificazione real-time nella determinazione della carica virale Parvovirus B19 e Papillomavirus umani Giorgio Gallinella

Real-Time PCR nella diagnosi virologica Diagnosi virologica e determinazione del carico virale La ricerca di acidi nucleici virali mediante PCR assicura: Specificità – la scelta nell’utilizzo dei primer determina il bersaglio della reazione Sensibilità – la definizione delle condizioni di reazione determina il livello di sensibilità della reazione La determinazione quantitativa mediante real-time PCR permette: Valutazione quantitativa come parametro diagnostico Valutazione quantitativa in corso di screening Valutazione quantitativa in corso di follow-up

Real-Time PCR nella diagnosi virologica Diagnosi virologica e determinazione del carico virale La determinazione mediante PCR end-point fornisce informazioni qualitative: Informazioni quantitative possono essere ottenute mediante modificazioni della tecnica di base (diluizioni end-point, PCR competitiva, …) La determinazione mediante PCR real-time fornisce informazioni quantitative: Informazioni quantitative possono essere ottenute direttamente mediante analisi in tempo reale delle curve di accumulo dei prodotti di reazione

Real-Time PCR nella diagnosi virologica Diagnosi virologica e determinazione del carico virale La tecnica di PCR real-time: Si basa sulla rivelazione dell’emissione luminosa di fluorocromi presenti nella miscela di reazione Fluorocromi intercalanti (SybrGreen) Flurocromi legati a sonde (FRET, Taqman, Molecular Beacons) Utilizza strumenti che sono in grado di rilevare in tempo reale l’emissione luminosa dei fluorocromi Thermal Cyclers a blocco Thermal Cyclers ad aria Utilizza software in grado di effettuare analisi quantitative e delle curve di melting dei prodotti di amplificazione

Real-Time PCR nella diagnosi virologica Diagnosi virologica e determinazione del carico virale Determinazione quantitativa mediante PCR real-time nello studio delle infezioni da Parvovirus B19 e Papillomavirus umani

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Caratteristiche molecolari di Parvovirus B19 Famiglia Parvoviridae Genere Erythrovirus DNA monocatenario  5600 nucleotidi Struttura icosaedrica Privo di pericapside

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Infezione da Parvovirus B19 Schema patogenetico dell’infezione da Parvovirus B19

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Infezione da Parvovirus B19 Principali manifestazioni cliniche dell’infezione da Parvovirus B19 Eritema infettivo Artralgie/Artropatie Crisi aplastica transitoria Idrope fetale e infezioni congenite Possibile sviluppo di infezioni persistenti Valutazione del carico virale per una più corretta valutazione del processo infettivo Necessità di valutare l’andamento temporale del carico virale nel corso di infezioni croniche o persistenti

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Infezione da Parvovirus B19 Vie di trasmissione dell’infezione da Parvovirus B19 Trasmissione aerogena Trasmissione materno-fetale Trasmissione mediante sangue ed emoderivati Necessità di valutare il carico virale nelle unità di donazione e nei pool di plasma per la produzione di emoderivati Valore soglia ammesso di contaminazione da parvovirus B19 nei pool di plasma per la produzione di emoderivati pari a 104 UI/ml

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Infezione da Parvovirus B19 Infezione in soggetti normali Picco viremico e graduale clearance virale Comparsa di anticorpi specifici di classe IgM e IgG Depressione transitoria della funzionalità midollare – scomparsa dei reticolociti, calo modesto dell’emoglobina Manifestazioni cliniche bifasiche: 1. Sintomi aspecifici 2. Rash, artralgia (quinta malattia)

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Infezione da Parvovirus B19 Infezione in soggetti con stress eritroide Picco viremico e graduale clearance virale Comparsa di anticorpi specifici di classe IgM e IgG Depressione acuta ma transitoria della funzionalità midollare – scomparsa dei reticolociti, calo profondo dell’emoglobina Manifestazioni cliniche legate allo stato di anemia profonda (TAC)

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Infezione da Parvovirus B19 Infezione in soggetti con deficit del sistema immunitario Picco viremico e ritardata o assente clearance virale Deficit (quantitativo e/o qualitativo) di anticorpi specifici di classe IgM e IgG Depressione persistente della funzionalità midollare – scomparsa dei reticolociti, calo profondo dell’emoglobina Manifestazioni cliniche legate allo stato di anemia profonda (PRCA)

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Diagnosi di infezione da Parvovirus B19 Materiale biologico Sangue periferico, plasma, siero Metodi di indagine Ricerca virus mediante PCR Determinazione anticorpi specifici anti-B19 (IgG+IgM) Rilevanza diagnostica Infezioni acute: malattia esantematica, artropatia crisi aplastica midollare Infezioni croniche: artropatia, aplasia eritrocitaria Infezioni in gravidanza: infezione materna

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Diagnosi di infezione da Parvovirus B19 Materiale biologico Sangue midollare, sangue fetale, liquido amniotico, biopsie tissutali Metodi di indagine Ricerca virus mediante PCR Ricerca virus mediante ibridazione in situ Rilevanza diagnostica Infezioni acute: crisi aplastica midollare Infezioni croniche: aplasia eritrocitaria Infezioni persistenti: presenza del virus nei tessuti Infezioni in gravidanza: infezione fetale

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Diagnosi di infezione da Parvovirus B19 Presenza di marcatori Numero di campioni Percentuale DNA neg/ IgM neg/ IgG neg 123 35.8 DNA pos/ IgM neg/ IgG neg 14 4.1 DNA pos/ IgM pos/ IgG neg 9 2.6 DNA pos/ IgM pos/ IgG pos 40 11.6 DNA pos/ IgM neg/ IgG pos 36 10.5 DNA neg/ IgM pos/ IgG pos 26 7.6 DNA neg/ IgM neg/ IgG pos 96 27.8 Campioni con marcatore unico Totale campioni 344 100

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Diagnosi di infezione da Parvovirus B19 Presenza di marcatori Numero di campioni Percentuale DNA neg/ IgM neg/ IgG neg 123 35.8 DNA pos/ IgM neg/ IgG neg 14 4.1 DNA pos/ IgM pos/ IgG neg 9 2.6 DNA pos/ IgM pos/ IgG pos 40 11.6 DNA pos/ IgM neg/ IgG pos 36 10.5 DNA neg/ IgM pos/ IgG pos 26 7.6 DNA neg/ IgM neg/ IgG pos 96 27.8 Campioni unicamente DNA pos 50 14.6 Totale campioni 344 100

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 La ricerca del DNA di Parvovirus B19 mediante PCR deve: Permettere una valutazione quantitativa del carico virale Includere l’utilizzo di un reagente di controllo analitico Modalità di quantificazione mediante real-time PCR: Quantificazione relativa (riferimento a campione calibratore) Quantificazione assoluta (riferimento a curva standard) Utilizzo di un controllo analitico interno Eterologo Omologo

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Metodi di indagine Ricerca virus mediante PCR Sono state descritte numerose coppie di primers che consentono un’efficiente amplificazione del bersaglio virale (del genoma virale oppure dellle diverse classi di messaggeri)

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Metodi di indagine Ricerca virus mediante PCR: PCR Real-Time Monitoraggio in tempo reale, ciclo per ciclo, della quantità di prodotto di amplificazione Rivelazione della fluorescenza emessa da un fluorocromo intercalante (SybrGreen) Rivelazione della fluorescenza emessa da fluorocromi legati a sonde oligonucleotidiche (FRET, Taqman, Beacons, …)

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Sviluppo di una tecnica di PCR real-time calibrata: Amplificazione in due reazioni parallele del bersaglio virale e di un bersaglio di riferimento eterologo Rivelazione dei prodotti di PCR mediante SybrGreen e definizione, per ciascuna reazione, di un crossing point Quantificazione relativa ad un campione calibratore a titolo noto mediante applicazione della formula: Etarget ed Ereference sono le efficienze, determinate sperimentalmente, delle due diverse reazioni di amplificazione Cp (calb-sample) sono le differenze fra i crossing point del campione calibratore e dei campioni in esame

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Ref Amplificazione parallela del bersaglio virale e del bersaglio di riferimento Virus Valutazione dell’efficienza della reazione: EVirus = 1.909 Valutazione della variabilità della reazione: CpVirus = 0.21-1.71% Riferimento Valutazione dell’efficienza della reazione: ERef = 1.658 Valutazione della variabilità della reazione: CpRef = 0.45-2.41%

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Analisi di regressione Slope 1.000  0.010 SD of Slope 0.006  0.002 Standard Error 0.1190.038 R2 0.996  0.002 Curve di regressione ottenute per la quantità calcolata di bersaglio virale rispetto alla quantità attesa, utilizzando come campione calibratore ciascun campione nell’intervallo 101-108 geq

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Determinazione quantitativa del carico virale in campioni di siero CAMPIONI PCR+, IgM+, IgG- N=3, Media: 1.1e9; Mediana: 1.4e9 CAMPIONI PCR+, IgM+, IgG+ N=24, Media: 4.3e6; Mediana: 8.7e4 CAMPIONI PCR+, IgM-, IgG+ N=11, Media: 3.7e5; Mediana: 3.2e4

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Analisi quantitativa mediante real-time PCR calibrata: Nei pazienti seguiti il carico virale è risultato compreso fra 102 – 106 geq/ml per periodi estesi di tempo Analisi mediante real-time PCR calibrata su campioni di siero ottenuti da pazienti con documentata infezione persistente da Parvovirus B19, utilizzando come calibratore lo standard internazionale NIBSC 99/800 all concentrazione di 104 geq/ml

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Analisi quantitativa mediante real-time PCR calibrata: In quattro campioni il carico virale è risultato superiore al valore soglia predefinito di 104 geq/ml Analisi mediante real-time PCR calibrata su 16 pool di plasma destinati alla produzione di emoderivati, costituiti ciascuno da 960 singole donazioni, utilizzando come calibratore lo standard internazionale NIBSC 99/800 all concentrazione di 104 geq/ml

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 I pool contaminati da Parvovirus B19 ad un valore superiore a 104 geq/ml sono risultati infettanti in esperimenti di infezione in vitro di cellule KU812Ep6, come dimostrato mediante ibridazione in situ, PCR e RT-PCR per la ricerca di acidi nucleici virali

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Sviluppo di una tecnica di PCR real-time competitiva: Amplificazione in unica reazione del bersaglio virale e di un bersaglio competitore Rivelazione dei prodotti di PCR mediante coppie di sonde con emissione di segnali FRET e definizione, per ciascuna reazione, di un crossing point Quantificazione assoluta mediante curve di calibrazione esterne ITR IR NS VP Competitore Coppie di sonde oligonucleotidiche e emissione di distinti segnali FRET

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Amplificazione del bersaglio virale e del bersaglio competitore Reazione di amplificazione Efficienza della reazione: EVirus = EComp = 1.98 Errore standard: 0.06; R2: 1.00; Effetto competitivo Amplificazione inibita in presenza di 1 Log in eccesso del bersaglio competitore Ad equimolarità, CpVirus-Comp = -0.68 – +0.90 Virus Comp

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Conclusioni (1) Caratteristiche delle tecnica di PCR real-time per la ricerca di Parvovirus B19: L’utilizzo di un bersaglio di riferimento come controllo analitico consente un monitoraggio sia delle fasi pre-analitiche che analitiche La quantificazione relativa ad un campione calibratore a titolo noto e la normalizzazione rispetto ad un bersaglio di riferimento eterologo consentono di minimizzare gli errori nella valutazione quantitativa La quantificazione assoluta mediante real-time competitiva risente in maniera sensibile degli effetti di interferenza reciproca, ma può consentire uno screening rispetto ad un valore soglia prefissato

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19 Conclusioni (2) Caratteristiche delle tecnica di PCR real-time per la ricerca di Parvovirus B19: La determinazione quantitativa del carico virale in campioni di sangue periferico consente di caratterizzare con maggior precisione il processo infettivo e di seguirne lo sviluppo nel tempo In prospettiva, la valutazione quantitativa dell’espressione virale in campioni tissutali può consentire di definire il ruolo patogenetico del virus in numerose situazioni di rilevanza clinica La diffusione del virus nella popolazione e la sua presenza nel sangue per periodi di tempo anche prolungati portano ad un rischio di trasmissione del sangue per via ematica: la valutazione quantitativa permette di discriminare i campioni di plasma con carico virale contaminante superiore al valore soglia di sicurezza

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Caratteristiche molecolari dei Papillomavirus Famiglia Papillomaviridae Genere Papillomavirus > 100 distinti genotipi DNA bicatenario  8000 nucleotidi Struttura icosaedrica Privo di pericapside

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Infezione da Papillomavirus Schema patogenetico dell’infezione da Papillomavirus LCR E6/E7 E1/E2 E4 E5 L1 L2 Inibizione trascrizione di E6/E7 Replicazione DNA Fattori cellulari Particelle virali complete Differenziamento cellulare

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Infezione da Papillomavirus Schema patogenetico dell’infezione da Papillomavirus TRASFORMAZIONE IMMORTALIZZAZIONE Blocco inibizione di E6/E7 LCR E6/E7 E1/E2 E4 E5 L1 L2 Integrazione

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR: Rivelazione del DNA di un ampio spettro di genotipi mediante reazioni di amplificazione che utilizzano coppie di primer di consenso Tipizzazione del genotipo virale mediante sonde oligonucleotidiche specifiche per i diversi genotipi Valutazione della persistenza dell’infezione da genotipi di HPV ad alto rischio oncogeno Determinazione della carica virale e dello stato fisico che assumono rilevanza: In caso di persistenza dell’infezione per valutare il rischio oncogeno Nel follow up di pazienti conizzate per CIN di alto grado per identificare i casi di infezione persistente dopo il trattamento

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: Metodi quantitativi che utilizzano pool di primer in grado di definire la carica virale di un ampio spettro di genotipi, in relazione al numero di cellule presenti nel campione, e che consentono la successiva genotipizzazione virale PCR real-time multiplex + tipizzazione in ELISA Metodi quantitativi genotipo-specifici per la valutazione della carica virale di HPV16 e HPV18 PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16 e HPV18 Metodi quantitativi genotipo-specifici per la definizione dello stato fisico di HPV16 e HPV18 PCR real-time regioni E2/E6 per HPV16 e HPV18

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: PCR real-time multiplex + tipizzazione in ELISA PCR Real Time di consenso: Amplificazione con pool di primer (MGP5Bio/MGP6) e marcatura dell’amplificato con Biotina Genoma HPV MGP5 Bio MGP6 E6 E7 E1 E2 E4 E5 L2 L1 150 bp BIO La quantificazione avviene mediante interpolazione su curve di calibrazione esterna, sia per il bersaglio virale (HPV) sia per il bersaglio cellulare (GAPDH) utilizzato per la normalizzazione

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: PCR real-time multiplex + tipizzazione in ELISA Genotipizzazione in ELISA: Cattura dell’amplificato su pozzetti streptavidinati e tipizzazione mediante l’utilizzo di sonde specifiche per HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 58 amplificato BIO streptavidina POD Ab anti-DIG sonda DIG genotipo specifica ABTS 52 06 11 16 18 31 33 35 45 58 sonde HPV A B C Amplificati

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16 2° trattamento di conizzazione Le pazienti che hanno un’alta carica virale iniziale e mostrano un decremento della carica virale dopo il trattamento risolvono spontaneamente l’infezione

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16 2° trattamento di conizzazione Le pazienti che hanno una bassa carica virale iniziale e mostrano una carica virale costante dopo il trattamento non risolvono spontaneamente l’infezione e mostrano una persistenza/recidiva della lesione

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: PCR real-time regioni E2/E6 per HPV16 CARICA VIRALE HPV 16 STATO FISICO HPV 16 La carica virale e lo stato fisico di HPV 16 sono importanti parametri per la valutazione del rischio oncogeno in pazienti con infezione persistente Nelle infezioni persistenti il DNA virale può integrarsi nel genoma umano, con interruzione dei geni E2/E1e conservazione dei geni E6/E7 DNA di HPV 16 episomiale: E2/E6 = 1 DNA di HPV 16 misto: 1< E2/E6 < 0 DNA di HPV 16 integrato: E2/E6 = 0

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus CARICA VIRALE: espressa come numero di copie di E6 per 100.000 copie di GAPDH CURVA STANDARD E6 CURVA STANDARD GAPDH Costruzione delle curve standard per E6 e per GAPDH La quantificazione del bersaglio virale E6 per ciascun campione è stata ottenuta per interpolazione del valore di Cp nella retta di regressione lineare della rispettiva curva standard, normalizzata sul valore corrispondente per GAPDH

STATO FISICO: espressa come rapporto di numero di copie E2/E6 Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Ricerca di Papillomavirus STATO FISICO: espressa come rapporto di numero di copie E2/E6 CURVA STANDARD E2 CURVA STANDARD E6 Costruzione delle curve standard per E2 e per E6 La determinazione del rapporto E2/E6 per ciascun campione è stata ottenuta per interpolazione del valore di Cp nella retta di regressione lineare delle rispettiva curve standard

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus E6 HPV 16 plasmid Full length HPV 16 plasmid E2 gene copies E6 gene copies Due cloni plasmidici sono stati utilizzati per valutare sperimentalmente i diversi valori del rapporto E2/E6, nell’intervallo relativo a 102 - 106 copie di E6 La PCR real-time può distinguere lo stato misto dallo stato episomiale quando più del 20% del DNA virale è allo stato integrato È possibile costruire una retta di regressione lineare per distinguere lo stato episomiale dallo stato misto in funzione del numero di copie di E6

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus STATO EPISOMIALE STATO MISTO Risultati dell’analisi per carica virale e stato fisico in 68 campioni citologici positivi per HPV 16 DNA – distribuzione dei valori quantitativi attorno alla retta di regressione dei valori di cut-off

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Stato fisico e carica virale Lesione e carica virale EPISOMALE MISTO INTEGRATO 29.4% 54.4% 16.2% LSIL HSIL IA1 22.0% 69.2% 8.8% Una elevata carica virale aumenta la probabilità di integrazione di HPV 16 nel genoma umano e rappresenta un fattore di rischio per la progressione a carcinoma invasivo Le cellule con DNA virale integrato acquistano un vantaggio di crescita sulle altre cellule infettate, si ha una selezione dei cloni cellulari con DNA integrato, un abbassamento della carica virale e una progressione della lesione

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Lesione e stato fisico La percentuale di DNA virale totalmente episomiale diminuisce con il progredire della gravità della lesione (LSIL - HSIL) La percentuale di DNA allo stato misto aumenta con il progredire della gravità della lesione (LSIL - HSIL) DNA virale totalmente integrato è presente solo in lesioni di alto grado (HSIL) e nei carcinomi invasivi

Real-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus Conclusioni (3) Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: L’andamento della clearance virale nel corso del follow up è indicativo della risoluzione o persistenza dell’infezione e quindi della possibile persistenza o recidiva della lesione Il decremento della carica virale conduce a risoluzione dell’infezione Il mantenimento della carica virale indica una persistenza dell’infezione La carica virale e lo stato fisico del DNA di HPVassumono rilevanza: Un’alta carica virale è associata allo stato episomiale di HPV16 Una bassa carica virale è associata allo stato integrato di HPV16 La quantificazione del DNA di HPV nello stato episomiale vs. integrato può assumere rilevanza nella valutazione del rischio oncogeno

Università di Bologna Dipartimento di Medicina Clinica Specialistica e Sperimentale Sezione di Microbiologia Monica Musiani Marialuisa Zerbini Giorgio Gallinella Giovanna Gentilomi Elisabetta Manaresi Francesca Bonvicini Stefania Delbarba Claudia Filippone Simona Venturoli Simone Ambretti Monica Cricca